[发明专利]具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有抗血管生成作用的融合蛋白及其编码基因与该融合蛋白的表达方法以及以该融合蛋白为活性成分的药物。

背景技术

近年来，中国的癌症患者人数一直居高不下，据《中国人口学报》统计，2005年中国的癌症患者人数达200万，其中140万不能得到有效医治，因此抗癌药物的研制成为了科技工作者的研究重点。传统的肿瘤治疗方法主要是针对肿瘤细胞，但在治疗过程中，常常由于肿瘤细胞发生遗传突变而产生抗药性，或由于化疗药物的毒副作用累积，导致整个治疗失败。

70年代，Judah Folk man提出了对抗肿瘤血管可以治疗肿瘤的假说[石伟，蔡瑞，张延龄，等.肿瘤血管生成抑制物作用机制及应用研究进展.国外医学肿瘤学分册，2001，28(1)：36-39]从而将抗肿瘤药物的研究带入了一个新的时代。肿瘤的生长和转移离不开新生血管。诸多研究表明，肿瘤血管生成是一个多因子参与的多步骤过程，基本步骤包括：①肿瘤组织释放血管生成刺激因子；②血管周围细胞外基质重塑，基膜降解；③内皮细胞增殖、迁移；④新生血管成形。阻断其中任何一步，都将阻碍肿瘤血管生成。近20多年来，许多具有抗血管生成作用的物质相继被报道，它们在血管生成的各个环节发挥作用，从而抑制肿瘤血管生成。

内皮抑素(Endostatin)是近年来发现的具有上述特异抗肿瘤作用的最有效血管生成抑制因子之一。1997年，美国哈佛大学医学院O’Reilly和Folk man等[O′ReillyMS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：an endogenous inhibitor of angiogenesisand tumor growth.Cell，1997，88(2)：277-285]首先从鼠血管内皮瘤细胞(EOMA)培养液中分离纯化到Endostatin。Endostatin为胶原蛋白XVIII的C末端片段，编码184个氨基酸，分子量为20kDa。内皮抑素抗肿瘤作用是通过抑制血管内皮细胞的增殖，增加凋亡，使肿瘤细胞维持在持续休眠状态实现的。采用内皮抑素作为抗肿瘤药物具有靶向性强、毒副作用小及不产生耐药性等优点。以血管内皮细胞为靶向的内皮抑素不会发生耐药性的根本原因在于内皮细胞是人体的正常细胞，具有相对的基因稳定性。内皮抑素是当前抗血管疗法中最具潜力的药物蛋白。早在1999年，美国FDA就批准了由巴斯德毕赤酵母表达的重组人内皮抑素作为治疗肿瘤药物的I期临床试验，2001年此项研究进入II期临床阶段。近年来，我国也开展了相关研究，但也存在着一些问题：其一，内皮抑素表现出明显的剂量依赖性的抑制作用，动物(鼠)试验表明，注射剂量为100ng内皮抑素/mL时，可抑制内皮细胞的增殖，当达到或超过600ng/mL时，抑制效应达到最大值，可见内皮抑素的需求量比较大；其二，内皮抑素的半衰期比较短，约为(10.7±4.1)h，病人需要每天大剂量注射，因此很多患者难以承受昂贵的医药费。

大肠杆菌具有产量高、成本低、生产周期短的特点，但胞内高水平表达的外源蛋白大多以不溶解、无活性的包涵体形式存在，而目前由包涵体中提取高水平、高比活的目标蛋白的最大问题是回收率低，大部分目标蛋白在复性中析出丢失；杆状病毒存在糖基化序列与天然蛋白不一致且蛋白表达产量不稳定等缺点，因此上述表达系统均不适用于外源蛋白的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种效果显著且半衰期较长的具有抗血管生成作用的融合蛋白。

本发明所提供的融合蛋白，命名为Endo-Albu，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：2；

3)序列表中的SEQ ID NO：3；

4)将序列表中SEQ ID NO：1-3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗血管生成作用的蛋白质。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。