[发明专利]一种高活性的人肝再生增强因子及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种高活性的人肝再生增强因子及其制药用途。具体而言，本发明涉及一种截短型的人肝再生增强因子，其可用于预防和/或治疗肝损伤，尤其涉及利用中、低剂量的所述人肝再生增强因子来预防和/或治疗肝损伤或制备相应药物。本发明还涉及所述人肝再生增强因子的制备方法及其编码核酸等。

背景技术

肝脏是人体的重要器官，肝损伤会对健康构成了重大危害，严重时甚至导致肝硬化和肝功能衰竭，其中急性肝功能衰竭不但起病急、预后差，而且病死率高。某些病毒，如在我国的人群中普遍发病率高的乙型肝炎病毒等，通过致肝细胞病变可以造成肝损伤。还有研究表明，针对某些病毒(如丙型肝炎病毒(HCV))的免疫反应也是引起肝损伤的主要原因。淋巴细胞(尤其是细胞毒T淋巴细胞)非但不能完全有效地清除HCV，反而在清除HCV感染的肝细胞的过程中会造成肝细胞的免疫性损伤，引起肝细胞调亡，由此甚至可以导致肝硬化和肝细胞性肝癌(例如可参见，Nelson等，J.Immunol.，158:1473-1481(1997)；Wong等，J.Immunol.，160：1479-1488(1998)；Ruggieri等，Virology，229：68-76(1997))。此外，众所周知，肝毒性化学物质也会引起肝损伤。已知一些药物通过氧化作用，尤其是产生的氧自由基，可以造成肝损伤，导致肝脏细胞溶解和肝坏死。例如镇痛药醋氨酚(即扑热息痛，化学名为4-(N-乙酰基氨基)酚)就是一种具有肝损伤作用的物质，在大剂量服用时会引起人的肝坏死。又如，长期服用利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等抗生素，以及更年期长期服用雌激素等也会造成严重的肝细胞坏死，导致急性或慢性肝炎、黄疸和肝纤维化等肝损伤。肝损伤是由肝脏细胞的病变、坏死而造成的，因此，促进肝细胞增殖，使肝细胞再生，是预防和治疗肝损伤、恢复肝脏功能的关键。

1994年，Hagiya等首先在大鼠的肝再生过程中获得了一个全长1.2kb的cDNA，包含375bp的开发读框，编码125个氨基酸的小分子蛋白，将其命名为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，缩写为ALR)。该鼠肝再生增强因子活性不受热、酸、碱、1g/LSDS、10g/Lβ巯基乙醇、8M脲处理影响，不为DNase、RNase、神经氨酸糖苷酶破坏，但可被蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等降解，分子量为15Kd左右。人们对ALR刺激肝细胞再生的机制还没有完全清楚，有报道认为，ALR通过跟胞外蛋白的受体结合激发胞内的MAPK途径发挥作用。纯化的ALR可促进小鼠及大鼠肝叶切除后的肝细胞DNA合成，且对脾、肺、肾、心、脑等脏器细胞无刺激生长作用，表明其活性存在肝组织特异性。但是对于人来说，鼠肝再生增强因子作为外源物质，其上的表位会诱导人免疫系统对其产生免疫反应，难以直接应用于预防和治疗人的肝损伤。

在大鼠ALR分子克隆的基础上，1999年刘杞等利用同源引物PCR技术获得了人肝再生增强因子(缩写为hALR)的基因组序列(Genbank号为AF146394)，据预测为375bp的开放读框，但该研究没有研究其活性。此外，在专利申请WO9748797A、WO9702346A、EP0668291A也公开了各种来源的ALR，但遗憾的是，都没有具体研究其活性。之后Lisowsky发现hALR基因有3种不同的剪切形式，由125个氨基酸组成的hALR仅为不成熟形式；而由204个氨基酸组成的全长hALR的形式为成熟形式，分子量为23kDa，主要分布于肝脏、肾脏，在组织中所占的比率最高，并且具有最强的生物学活性。受此认识的影响，此后的研究集中于全长hALR，如中国专利CN1233839C、CN1795924A，没有触及不成熟形式(截短型)的人肝再生增强因子。另外，中国专利CN1532285A涉及ALR的同源二聚体蛋白，而CN1727479A涉及ALR作为免疫抑制剂的用途，也没有涉及不成熟形式(截短型)的人肝再生增强因子，更没有涉及hALR治疗肝损伤的剂量。