[发明专利]调节G蛋白偶联受体活性的化合物的筛选方法

权利要求书

1.鉴定使甜味化合物增甜的候选化合物的方法，包括下列步骤：

a.提供包含或表达功能性G-蛋白的转化的真核宿主细胞，其中所 述宿主细胞转化有编码至少两种不同的G-蛋白偶联受体GPCR的基因 序列，其中转化使用三顺反子表达载体来完成，所述三顺反子表达载 体包含三顺反子表达单元，所述表达单元含有位于真核宿主表达用启 动子的下游、并且在功能上与其相连的下列顺反子：

I.GPCR₁

II.GPCR₂，以及

III.选择性标记，

其中GPCR₁和GPCR₂的组合是T1R2/T2R3味觉异源二聚体受体， 其中GPCR₁和GPCR₂以及选择性标记都通过插入内部核糖体进入位点 IRES在功能上相连，

b.将转化的宿主细胞在足够使所述至少两种不同的GPCRs功能 性表达的条件下进行培养，

c.将培养的以功能性方式表达至少两种不同的GPCRs的宿主细 胞与甜味化合物和可能使甜味化合物增甜的候选化合物相接触，

d.测量转化的宿主细胞在接触甜味化合物和候选化合物时的细 胞内钙水平，以及

e.选择候选化合物，所述候选化合物在甜味剂存在下增加细胞内 钙水平，高于由甜味化合物单独产生的水平，

其中细胞内钙水平的增加指示该候选化合物使甜味化合物增甜。

2.权利要求1的方法，其中宿主细胞选自：人类胚胎肾脏细胞 HEK293、黑人子宫颈表皮样癌细胞Hela、高加索人IQ级结肠腺癌细 胞HT29、人类鳞状上皮细胞癌细胞A431、高加索人成神经细胞瘤细 胞IMR32、高加索人慢性髓性白血病细胞K562、高加索人组织细胞淋 巴瘤细胞U937、高加索人乳腺腺癌细胞MDA-MB-231、高加索人成神 经细胞瘤细胞SK-N-BE(2)、人类成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y、人类早 幼粒细胞性白血病细胞HL60、中华仓鼠卵巢细胞CHO-K1、用SV40 转化的非洲绿猴肾脏细胞COS-7、小鼠淋巴瘤细胞S49、小鼠C34/一 种结缔组织细胞Ltk、小鼠成神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤的杂交细胞 NG108-15、大鼠神经组织神经元细胞ECACC B50、大鼠神经胶质瘤细 胞C6、人类T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、叙利亚仓鼠肾脏细胞BHK、 白化病小鼠成神经细胞瘤细胞Neuro-2a和小鼠胚胎成纤维细胞 NIH/3T3。

3.权利要求1的方法，其中的选择性标记选自潮霉素、zeocin、 新霉素、杀稻瘟素和嘌呤霉素。

4.权利要求1的方法，其中内部核糖体进入位点IRES选自：从 脑心肌炎病毒衍生的IRES_EMCV、从GTX同源域mRNA衍生的IRES_GTX、 从可冷诱导的Rbm3衍生的IRES_Rbm3、从脊髓灰质炎病毒复制原点衍生 的IRES_PV、从鼻病毒衍生的IRES_RV、从口蹄疫病毒衍生的IRES_FMDV、 从丙型肝炎病毒衍生的IRE_HV、从经典的猪瘟病毒衍生的IRES_CSFV、从 牛病毒性腹泻病毒衍生的IRES_BVDV、从弗里德鼠白血病病毒gag mRNA 衍生的IRES_FMLV、从莫洛尼鼠白血病病毒gag mRNA衍生的IRES_MMLV、 从人类免疫缺陷病毒env mRNA衍生的IRESHIV、从大豆尺蠖(Plautia  stali)肠病毒衍生的IRES_PSIV、从禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病 毒衍生的IRES_RPV、从卡波西肉瘤相关的疱疹病毒衍生的IRES_KSH。

5.权利要求1的方法，其中的三顺反子表达单元被多聚腺苷化信 号所终止。

6.权利要求1的方法，其中的候选化合物选自小分子和肽。