[发明专利]重组融合表达串联抗菌肽基因的方法

说明书

技术领域

本发明技术涉及重组表达技术，特别是串联的抗菌肽基因的重组融合表达

背景技术

目前抗菌肽基因的重组表达，主要有以下两种方式：一通过与GST或TrxA融合来表达单拷贝的抗菌肽基因，其优点有利于提高抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达，缺点为通常目标多肽在融合蛋白中所占比例低；二、直接通过串联目标多肽基因来表达，该法虽然表达产物中目标多肽的比例较高，但缺少GST或TrxA融合蛋白提高抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达等优点。

发明内容

本发明是一种重组融合表达串联抗菌肽基因的方法，通过与TrxA融合来表达多拷贝的抗菌肽基因，既利用多拷贝来提高目标多肽在表达产物中的比例，又通过融合蛋白来提高串联抗菌肽基因的表达量和促进可溶性表达，克服了融合蛋白表达单拷贝抗菌肽基因法存在目标多肽在融合蛋白中所占比例低以及直接串联目标多肽基因法存在表达量和可溶性低的缺点。采用本发明能实现串联抗菌肽基因的高效表达，优化条件下，总的重组融合抗菌肽表达量超过2mg/mL(提取液)。

附图说明

图1阳性重组子PCR扩增产物

1，11：100bp Ladder(由上至下：1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp)；2：空质粒pET32a(+)扩增产物；3-9：含单拷贝到7拷贝编码基因的重组子扩增产物；10：含9拷贝编码基因的重组子扩增产物.

图2电泳分析融合蛋白诱导结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)2：诱导前对照；3-10：pET32-(LfcinB15-W4，10)_1-7，9IPTG诱导后结果

图3LfcinB15-W4，10四聚体融合蛋白纯化结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)；2：诱导后细胞总蛋白；3：诱导前细胞总蛋白对照；4：融合四聚体Ni²⁺螯合层析纯化结果.

图4目的融合蛋白凝血酶酶切电泳结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)；

2：目的融合蛋白酶切前；3：酶切24h结果；4：酶切48h结果。

图5SDS-PAGE电泳分析多肽四聚体电洗脱回收结果

1：蛋白质marker(由上至下：94.0，66.2，45.0，35.0，28.5，20.0，14.4kDa)；

2：融合蛋白经凝血酶酶切后混合物；3：四聚体电洗脱回收产物

图6重组LfcinB15-W4，10四聚体抑菌活性分析

(A)：对照50μl PBS；(B)：50μl合成LfcinB15-W4，10单体(200μg/ml)；

(C)：50μl重组LfcinB15-W4，10四聚体(300μg/ml)

具体实施方式

重组表达载体构建及转化子鉴定

根据大肠杆菌密码子的偏好性设计基因核苷酸序列，分别合成正义链和反义链，通过非镜像对称互补粘性末端形成多拷贝基因，与含BamH I酶切位点的前接头和含Hind III酶切位点的后接头连接。带有接头的多拷贝基因经HindIII和BamH I酶切后与线性化pET32a载体连接构建重组质粒表达载体pET32a-(LfcinB 15-W4，10)_n，转化大肠杆菌DH5α后，经菌落PCR鉴定、根据扩增产物的片段大小筛选得到含有不同拷贝数编码基因的阳性重组子。

图1显示了PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。经DNA测序鉴定后得到阅读框架和核苷酸序列均正确无误的含有8个不同拷贝数编码基因的重组子。

融合蛋白的诱导表达