[发明专利]一种蛇毒血凝酶Ⅰ级酶制品及其生产方法

说明书

本申请是2003年05月13日申请的，申请号是03131420.1，发明名称为“一种蛇毒血凝酶及其生产方法与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种血凝酶及其生产方法与应用，特别是涉及一种蛇毒血凝酶I级酶制品及其生产方法与应用。

背景技术

血凝酶以纤维蛋白I为作用底物，迅速转入血管受伤部成为纤维蛋白凝块，阻止血液自受伤部位流出。凝血过程大致分为三个阶段，即凝血因子X的激活；血凝酶原的激活；纤维蛋白原变成纤维蛋白。能使纤维蛋白原变成纤维蛋白的作用称为类血凝酶样作用；能通过激活凝血因子X及血凝酶原而发挥作用的，称为类凝血激酶样作用。蛇毒中含有丰富的蛋白酶，其中一类丝氨酸蛋白酶与蛇伤造成的血液凝固失调等毒理作用密切相关，属于血凝酶类。很多血凝酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)已经从各种蛇毒中提纯，并已先后用于制备临床用药。

1767年，Fontana首次叙述了蛇毒的凝血作用，此后二百多年来，有关蛇毒应用于血液系统的研究不断取得成绩。

1967年从马来亚红口蝮(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒中分离的血凝酶样酶(促纤维蛋白原凝固酶)具有脱纤维蛋白的作用，可用于临床，已命名为Ancrod或Arvin，是一种单链的糖肽，含碳水化合物25-36％，由17个氨基酸组成，等电点6.5，分子量35400D±1400D(Ewart，M.R.，Biochem J.1970，118，603；Collins，J.P.etal.Eur.J Biochem，26，510)。人体静脉或皮下注射Ancrod，血浆纤维蛋白原水平会依据剂量而减少，因此这种酶制剂Ancrod可用于防治血管栓塞性疾病，又由于它的作用靶位是纤维蛋白原的Aa链，还可用于研究纤维蛋白原到纤维蛋白的转换。

Ouyang(Ouyang，C.，(1957)J.Formosan Med.Assoc，56，435)将从尖吻蝮(Akistrodon acutus)蛇毒中分离的血凝酶样酶称为Acutin，分子量24000，等电点酸性，它作用于纤维蛋白原的a链，分解出纤维蛋白肽A。它还进一步降解已形成的纤维蛋白的a链。Acutin引起纤维蛋白原凝结，形成对血浆溶解高度敏感的结块。Komori等(1988)从尖吻蝮蛇毒中分离出4种具有不同化学和免疫学特性的血凝酶样酶，都能从血纤维蛋白原中分解出纤维蛋白肽A，但其中仅有一种酶像血凝酶一样，能激活凝血因子XII。

昆明动物研究所将从尖吻蝮蛇蛇毒分离出的Acutin称为“去纤酶”应用于临床治疗脑血栓、心脏血栓、眼底静脉血栓及脉管炎，疗效显著。

蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)蛇毒中所含的血凝酶样酶，像铜头蝮的A.contortrix毒一样，能选择性地从纤维蛋白原分解出纤维蛋白肽B，是一种单链的糖蛋白，分子量43000D(Ouyang，C.，etal.，(1983)Toxicon，21，797)。该酶的酶活能可被DFP(二异丙基磷酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)所抑制，具精氨酸酯酶特性，它分解苯甲酰精氨酸乙酯比胰蛋白酶快2.5倍，分解TAME(对甲苯磺酰精氨酸甲酯)则比胰蛋白酶慢50倍。蝮蛇蛇毒中分离的酶凝结纤维蛋白原很慢，释放血纤肽的动力学分析表明：血纤肽Bβ链分裂出来较快，而释放导致凝块形成的血纤肽则较慢，它不像铜头蝮那样由温度取决酶活力大小。我国用于提取抗凝酶的毒蛇已有尖吻蝮、蝮蛇(蛇岛、浙江)。

从南美洲铜头蝮(Agkistrodon contortrix)蛇毒中分离的酶称为“Venzyme”，能从血纤维蛋白原中迅速地分解出血纤肽B，而较慢地释放血纤肽A。Venzyme分子量为64000D，不稳定，在pH 3时空气中暴露2小时，酶活力丧失；pH 10下放置2小时，活性损失60％，pH 7时60℃加热30分钟，活力丧失95％(Shimizu，A.，et.al.，(1987)Toxicon，21，679)。由于Venzyme作用于纤维蛋白原的Bβ链，这种独特性可用于研究那些作用于Aa-链的血凝酶(如红口蝮、矛头蝮和响尾蛇的“Anrod”、“batroxobin”、“Crotalase”)形成和血凝酶交叉组合的理化特性。

从蝮蛇日本亚种(Agkistrodon haly brevicaudus)蛇毒中分离的血凝酶(纤凝精氨酸蛋白酶)是分子量为39000D的糖肽，由323个氨基酸残基构成，分子中谷氨酸和天冬氨酸含量较高。