[发明专利]一种活菌多价疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了一种活菌多价疫苗的制备方法，与传统的方法相比，其可以通过吸入和/或口服表达传染性支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒相关抗原的减毒鼠伤寒杆菌，达到经一次免疫为上述5种病毒感染提供保护的目的。

背景技术

禽类，特别是肉鸡，由于生产周期短，鸡肉的营养价值较高，受到了西方一些发达国家消费者的喜爱。与我国消费观念不同的是，西方消费者除了食用分割鸡外，也特别喜欢整鸡的消费。因此，对整鸡的外观有相当的要求。目前我国鸡用疫苗大部分均采取注射的方法，注射后均存在不同程度的炎性反应，会在皮肤上留下疤痕，因此会影响到肉鸡的出口。

我国目前使用的禽用疫苗，除二联苗外，绝大部分为单价疫苗。单价疫苗的注射不仅会引起局部的炎性反应，在皮肤上留下疤痕外，因我国的肉鸡饲养数量巨大，疫苗注射也是一种繁重的人工作业。单价疫苗不仅增加了生产成本，同时因需要使用多种疫苗，也增加了肉鸡的成本。

因我国与西方发达国家的人工饲养条件不同，我国的肉鸡因抗生素残留，接种某些疫苗而使出口受阻。我国肉鸡的饲养量占全世界第二位，仅次于美国，而世界市场的占有率不足百分之一。

鼠伤寒杆菌因可以与肠壁和鼻腔的上皮细胞特异性结合，进而感染巨噬细胞并在巨噬细胞内增殖，而巨噬细胞作为特异性的抗原加工和呈递细胞，可以刺激机体的免疫系统，使机体产生体液和细胞免疫反应。这样通过在鼠伤寒杆菌体内特异性的表达病毒抗原，并给动物喂服和/或吸入这种基因工程改造的细菌，可以刺激产生针对病毒的保护性体液和细胞免疫反应，进而使宿主不再受野生病毒株的感染。

本发明专利以对人、畜无毒的鼠伤寒杆菌为载体，将传染性支气管炎，马立克氏病，法氏囊病，新城疫和禽流感病毒的相关抗原的表达基因，整合在鼠伤寒杆菌的染色体中，这样不仅可以降低疫苗的生产成本，通过用一种疫苗预防上述5种疾病，同时通过使用减毒的鼠伤寒杆菌，可以使鸡产生针对鼠伤寒杆菌的抗体，降低野生型鼠伤寒杆菌引起人类腹泻的可能性，达到一举六得，为我国肉鸡的出口提供较高的技术优势；通过删除国外用于检测我国疫苗接种反应所对应的抗原片断，这样我们仍然可以在提供对相应病原保护的同时，避开国外为我国设置的技术壁垒，促进我国的肉鸡出口；表达上述六种病毒的减毒鼠伤寒杆菌可以通过口服或吸入途径免疫，大大降低了生产成本和接种的劳动强度，消除了疫苗经注射接种后的皮肤疤痕，有助于提高我国肉鸡在国际市场上的竞争力。

发明的内容

发明的目的：通过吸入和/或口服表达传染性支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒相关抗原的减毒鼠伤寒杆菌，达到经一次免疫为上述5种病毒感染提供保护的目的。

为了达到上述目的，特采取下列方法：

1、用同源重组方法，将编码传染性支气管炎、传染性喉支气管炎、马立克氏病、法氏囊病、新城疫和禽流感病毒的相关抗原的基因片断，定向插入到鼠伤寒杆菌染色体的特异性位点，通过抗原编码基因的表达，经接种动物后诱导产生特异性的免疫保护反应。

2、权力要求书1所述，同源重组方法是将在所要插入基因位点两侧的核酸序列通过聚合酶连反应和/或分步克隆的方法，分别连接到病毒抗原编码基因的5’和3’端，作为同源序列将病毒抗原编码基因整合到鼠伤寒杆菌的染色体中。

3、如权利要求书1所述，病毒抗原编码基因通过同源重组的方法整合到鼠伤寒杆菌染色体中，可以通过将相关的基因片断直接射入到细菌中和/或通过细菌之间的杂交来完成。

4、如权利要求书2所述，位于病毒抗原编码基因两侧的同源序列可以是与鼠伤寒杆菌的毒性相关的蛋白的编码基因和/或调控序列，通过在毒性相关的基因的编码序列或调控序列中插入病毒抗原编码基因，使毒性相关基因和/或调控灭活，而使鼠伤寒杆菌减毒。

5、如权力要求书1所述，病毒相关抗原编码基因的表达，可以通过只有在鼠伤寒杆菌进入巨噬细胞后才诱导的促进子所控制，通过定时诱导抗原基因的表达，增加鼠伤寒杆菌的稳定性。

6、如权利要求书1所述，病毒相关抗原编码基因可以融合到鼠伤寒杆菌III型分泌系统效应蛋白基因的羧基端，使病毒相关抗原在鼠伤寒杆菌入侵巨噬细胞后，分泌到巨噬细胞的胞浆中，使诱导产生的免疫反应更加倾向于细胞毒免疫，有利于对病毒感染的保护。

7、如权利要求书1所述，病毒相关抗原的编码基因可以通过重叠聚合酶连反应和/或分步克隆的方式连接在一起。