[发明专利]一种多基因片段的亚克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，公开了一种多基因片段的克隆方法，与传统的方法相比，其可以通过末端兼容的酶切位点的反复消除和引入，完成多个基因的克隆。本方法可以用于基因组的改造，疫苗的制备和诊断试剂的生产。

背景技术

基因克隆是基因组改造的最基本方法。单个基因的克隆比较容易完成，而多个基因特别是像类似于整个病毒基因组序列的克隆，目前操作起来仍然比较困难。重叠PCR可以用于少数几个基因的连接和克隆，但仍然无法用于十多个或数十个基因的克隆。而将十数个或数十个基因置于一个操纵子之下，是一种最有效、最经济的基因组改造的方法，其可以用于大规模的代谢通路的改造，病毒疫苗的制备和诊断试剂的生产。

限制性内切酶，特别是II型内切酶，因其特异性的辨认序列，广泛用于分子生物学领域。本发明专利根据某些限制性酶切位点末端的兼容性，通过基因克隆这一过程反复的消除和引入酶切位点，使得利用有限的限制性内切酶，就可以完成多个基因的克隆，使基因克隆过程酶切位点的选择大为简化，并使代谢通路的改造和病毒全基因组疫苗的制备大为简化并易于操作。

发明的内容

发明的目的：利用某些限制性内切酶位点末端的兼容性，通过基因克隆这一过程反复的消除和引入酶切位点，使得利用有限的限制性内切酶，就可以完成多个基因片段的克隆，而达到对基因组进行大规模代谢通路的改造、诊断试剂的生产和病毒全基因组疫苗的制备目的。为达到上述目的，特采取下列方法：

1、一种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片段反复连接和/或克隆的方法。

2、如权力要求书1所述，通过反复消除和引入末端兼容性的酶切位点，而重复DNA片段的克隆过程。

3、如权力要求书1所述，酶切位点的消除是通过将末端兼容的酶切产物相互连接在一起完成的。

4、如权力要求书1所述，酶切位点的引入是通过在聚合酶连反应的引物中人工合成来完成的。

5、权利要求书1所述，这种利用末端兼容性的限制性内切酶进行多个DNA片段反复连接的方法可以在微生物体内通过特异性的克隆和/或表达质粒载体来完成。

6、如权利要求书1-5所述的方法，可以用于基因的克隆和表达，可以用于诊断试剂、疫苗和代谢通路的改造。

具体实施方式

限制性内切酶是基因工程操作的最基本的工具之一。基因的克隆和表达都离不开限制性内切酶的使用。限制性内切酶，特别是II型内切酶，因其特异性的识别序列酶切所产生的特异性末端而广泛用于基因的克隆过程。

细菌代谢通路的改造是一项新兴的研究课题，通过将属于不同细菌或其它微生物代谢通路的酶引入，可以使微生物具有新的功能和性状。这种经基因工程改造的微生物可以广泛用于生物化工原料、生物能源和环境污染的防治。细菌代谢通路的改造往往涉及到几个和十数个有功能活性的基因的克隆，并且将这些基因置于一个或少数几个促进子的控制。采用现有的方法进行这种大规模的克隆，不仅费时，而且实施起来也很困难。因为随着基因片段的加长，可选择的合适的内切酶越来越少。

目前除了乙肝外，几乎所有的疫苗都是灭活或减毒的全基因组疫苗。这是因为在病毒与宿主的长期共同进化的过程中，病毒通过与宿主发生多点相互作用，以确保不因宿主在单一的某个点上产生抗体或抵抗，而使其灭绝。因此，只有通过接种使宿主产生多种抗体或细胞毒效应，方能有效预防病毒的感染。这也是灭活或减毒疫苗有效的原因之一。而利用传统的方法，对全基因组进行克隆，不仅费时，而且很难操作，因为随着所需要克隆的DNA片段长度的增加，可供选择的酶切位点越来越少。

随着临床医学的进展，人们对疾病的诊断水平的要求越来越高，都希望通过最少量的样本获取最多的信息。而将多种病原或自身的抗原编码基因整合到一条DNA连中，也需要进行多片段的克隆。而采用传统的方法，也比较费时，费力。

下面以克隆I型艾滋病毒的全基因组为例，说明本专利的实施过程：

1.根据艾滋病毒的全基因组序列，确定下列末端互补的限制性内切酶在整个基因组中没有酶切位点，NarI GG/CGCC，ClaI AT/CGAT，BssHII G/CGCGC和MluI A/CGCGT，且NarI和ClaI互补，BssHII和MluI互补，及其连接产物将不能被各自对应的内切酶酶切。