[发明专利]采集扇贝高浓度精液的方法

说明书

技术领域：

本发明属于海洋生物技术领域，系贝类遗传育种研究中的技术改进，是一种在扇贝繁殖盛期采集高浓度、高成熟率和低激活率扇贝精液的技术方法。

背景技术：

精液的采集一般是指人工授精研究或在生殖障碍研究中以获取精液为研究对象的技术方法。

目前收集贝类精液大多采用解剖法和自然排放法，前者不能保证所得到的精子完全成熟，后者不能避免精子过早被海水激活。如鲍鱼精液的收集通常采用阴干和升温相结合诱导亲鲍排精，再离心浓缩产至海水中的精子[Liliana Salinas-Flores等，Journal of shellfish，2005，24(2)：415-420；Gwo Jin-Chywan等，Theriogenology，2002，58：1563-1578]，但离心浓缩所得到精子因长时间与海水接触，能量损失相对较多；Hughes(Cryobiology，1973，10：342-344)和Zell等(Cryobiology，1979，16：448-460)研究表明这种海水—精子混合物用于牡蛎精子冷冻效果并不理想，而采用解剖性腺组织的方法获得精液比较成功，但同样不能保证所获得的精子完全成熟，且精液中残留不少其它的组织细胞。通过对扇贝的精子冷冻保存及授精试验，发现一种采集高浓度、高成熟率和低激活率扇贝精液的方法，目前尚未见有关报道。

发明内容：

本发明的目的是采用一种便捷的方法收集到高浓度、高成熟率和低激活率的扇贝精子，以适用于精子冷冻保存和授精试验的研究，为克服扇贝育种过程中远缘杂交生殖隔离以及不同地域不同时间开展品种改良的难题铺平道路，以期在培育出生长快、抗逆能力强的优质亲贝的基础上，收集高浓度且品质佳的扇贝精液，用于培育优质苗种，从而有效遏制目前存在的品质下降，大面积死亡问题，为扇贝养殖业的持续稳定发展提供了一条新的出路。

本发明是按照以下操作方法完成的：

它的方法包括：1、优质亲贝的培育；2、制备吸取精液的吸头；3、高浓度精液的采集；4、检测收集精子的活力。

1、优质亲贝的培育：以壳高为标准，从养殖海区选择生长速度快，健康活泼的雄性扇贝进行暂养。虾夷扇贝壳高9～11cm，暂养密度每立方米水体20个，暂养水温4～8℃；栉孔扇贝壳高6～7cm，暂养密度每立方米水体80个，暂养水温14～16℃。投喂硅藻、金藻及螺旋藻，每天倒池一次。

2、制备吸取精液的吸头：材料为200μL黄颜色的吸头，吸头尖端用锋利的刀片略微倾斜削去部分(0.5-1cm)并修平整，使其既能在肾孔端附近扎破肾管，又可尽量减少吸力和毛边对精子的机械损伤。

3、高浓度精液的采集：待亲贝性腺充分成熟、个别出现排精现象时，挑选性腺饱满的雄贝，阴干升温刺激使其排放精子，观察到排精后，立即从海水中取出，用制备的200μl吸头，在肾孔端附近扎破肾管并吸取精液，放入冰上预冷的Eppendorf管中备用。

4、检测所收集精子的活力：取5μL精液，用195μL海水稀释40倍，将计数板放于显微镜的载物台上，盖上盖玻片；迅速取一滴稀释的精液于血球计数板盖玻片的边缘使精液自动均匀渗进计数室；置于200倍或400倍显微镜下观察精子活动情况，借助计数板上的标准网格进行目测计数，观察精子浓度及各活动类型的精子数目；精子的活动有三种类型：前进运动、旋转运动和仅尾巴摆动运动，评价精子活力是根据前进运动精子数多少及其占全部精子数的百分比来确定，所测精子的活力达到80-100％。

与已有技术对比，本发明技术具有如下特点：

1.收集方法简单，易于操作。只需了解扇贝的生殖腺及排泄器官的解剖结构，精确辨别出肾管便可进行精液的采集。一般雄性虾夷扇贝通过该方法可收集到约1.5mL精液/只，栉孔扇贝可收集到约0.6mL精液/只。

2.采用本方法获得的精液浓度高，为0.2-1.6×10⁹个/mL；成熟度也高，高达100％，因为精子只有充分成熟以后才能连同精液一起排放到肾管中，再从肾孔排出至体外；肾管中的海水很少，因而精子基本上不被激活。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明：

最佳实施例具体操作工艺过程：