[发明专利]检测细胞内氢离子的荧光探针及合成方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及用于检测细胞内氢离子的荧光探针；本发明还涉及该荧光探针的合成方法；另外，该发明还涉及该荧光探针的用途。

背景技术：

氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢及细胞内的参数，在许多细胞过程中起到关键的调节作用，比如细胞生长、钙离子调节、酶活性、信号传导、细胞内吞作用、化学向性及其他的细胞过程。许多报道认为一些疾病如癌症、肾衰竭、肺病等与细胞质或者酸性细胞器内的pH异常有关。因此，细胞内pH的精确测量是非常重要的。

目前，许多方法可用于检测pH。比如微电极、核磁、吸收及荧光光谱方法。在这些方法中，荧光法由于其非入侵的性质、高的灵敏度和专一性，以及广泛可用的荧光染料在测定pH时比其他方法更为优越。而且，荧光显微成像技术通过使用荧光pH探针能够捕捉到细胞内氢离子的时空分辨。

现在，两类荧光pH探针已经被开发，一类是用于检测细胞质内pH的探针，其工作pH范围大约是6.8-7.4(K.M.Sun，C.K.McLaughlin，D.R.Lantero and R.A.Manderville，J.Am.Chem.Soc.2007，129，1894-1895；M.S.Briggs，D.D.Bums，M.E.Cooper and S.J.Gregory，Chem.Commun.，2000，2323-2324；J.A.Thomas，R.N.Buchsbaum，A.Zimniak and E.Racker，Biochem.1979，18，2210-2218；A.H.Lee and I.F.Tannock，Cancer Res.1998，58，1901-1908；R.Pal and D.Parker，Chem.Commun.2007，474-476)；另一类是用于检测酸性器官如溶酶体，内涵体等的探针，其工作pH范围大约是4.5-6.0.(H.-J.Lin，P.Herman，J.S.Kang and J.R.Lakowicz，Anal.Biochem.2001，294，118-125；F.Galindo，M.I.Burguete，L.Vigara，S.V.Luis，N.Kabir，J.Gavrilovic andD.A.Russell，Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，6504-6508.)；Bo Tang，Xia Liu，Kehua Xu，Hui Huang，Guiwen Yang and Liguo An，众所周知，细胞内pH的微小变化可能引起细胞的功能紊乱，理想的荧光探针应当灵敏的响应细胞内pH的微小变化，并且能够避免来自细胞生物本身的干扰。然而，目前可用的pH荧光探针有以下缺点：低的灵敏度，有的激发在紫外区。激发在紫外区能够损伤组织样品并且引起生物样品自发荧光的干扰。另外，用于检测酸性器官内的理想的pH探针较少，这被认为是细胞生物学及医学发展的瓶颈。

发明内容：

本发明的目的之一旨在克服现有技术荧光探针的不足之处，提供一种具有高的灵敏度、好的选择性、好的光稳定性以及工作pH在酸性范围、适用于检测细胞内氢离子的荧光探针；目的之二是提供工艺简单、成本低廉的该荧光探针的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

该荧光探针具有下列结构通式：

本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：

该合成方法按如下步骤进行：

a.先将罗丹明类荧光染料溶于有机溶剂中，再按照罗丹明类荧光染料∶氧氯化磷＝1∶2-5重量份配比于搅拌下缓慢加入氧氯化磷，然后于40-60℃加热回流反应小时；

b.反应完毕后冷却至室温，减压除去溶剂，先加入有机溶剂溶解后，再按照罗丹明类荧光染料：氢离子响应基团＝1∶1-3重量份配比加入氢离子响应基团，混合后于80-100℃加热回流1-2小时；

c.然后冷却至室温，减压除去有机溶剂得到粗产品；

d.硅胶柱层析分离得结构通式为

的产品。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：

所述的罗丹明类荧光染料选自罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明800、罗丹明110。所述的氢离子响应基团选自苯甲酰肼、对甲苯基苯甲酰肼、邻甲基苯甲酰肼、间甲基苯甲酰肼。所说的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、乙醇。

本发明代表性的化合物显示在下面的合成方案中