[发明专利]一种构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法

权利要求书

1.一种构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，包括抗细胞附着的模型建立，肝癌细胞体外转移模型的建立，对所构建的肝癌体外转移模型的鉴定，其特征是：

所述抗细胞附着模型的建立方法是：用95％-100％的乙醇溶解poly-HEMA，配成poly-HEMA终浓度为120mg/ml的溶液，65℃震荡混匀8-10小时，得poly-HEMA储备液；然后将poly-HEMA储备液按体积比1∶10的比例用95％-100％的乙醇稀释，制成终浓度为12mg/ml的poly-HEMA工作液，4℃保存，备用；取poly-HEMA工作液均匀铺到细胞培养板或细胞培养瓶的底面上，铺板时poly-HEMA工作液终密度为1mg-3mg/cm²，室温下自然晾干poly-HEMA工作液，得抗细胞附着模型，4℃保存，备用；

所述肝癌细胞体外转移模型建立的方法是：选取具有高转移力的、处于对数生长期的BEL-7402细胞，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液后，调整细胞浓度为1-5×10⁵个细胞/ml，然后将其分成两组，一组接种至上述抗细胞附着模型中，设定为悬浮细胞组，另一组接种至非抗细胞附着模型的细胞培养板或细胞培养瓶中，设定为贴壁细胞组，待细胞铺匀后置37℃，CO₂培养箱中培养12h-48h，获得的悬浮细胞组细胞即为肝癌细胞脱离附着的体外转移模型，获得的贴壁细胞组细胞为肝癌细胞贴壁生长的对照模型；

所述对所构建的肝癌体外转移模型鉴定的指标特征是：在台盼兰染色确定悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞存活率不低于97％的前提下，①悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞凋亡率低于5％；②悬浮细胞组与贴壁细胞组细胞形态对比，悬浮组细胞聚集成团，没有突起伸出，细胞仍为圆球型，细胞在悬浮后4h出现聚集，36h细胞聚集更紧，呈现融合状态，随着时间的推移，贴壁组细胞由伸出突起开始逐渐伸展，铺成单细胞层，而悬浮组的细胞形态呈圆形，并逐渐聚集成团，所聚成的细胞团块随着时间的推移越聚越大；③细胞生长曲线显示，贴壁组细胞呈旺盛增殖曲线，悬浮组细胞处于静止状态，既不增殖，也不凋亡，呈基本持平曲线；④流式细胞仪检测各细胞周期的细胞分布显示，悬浮组细胞为处于G0/G1期的静止状态的细胞，而贴壁组细胞大多处于增殖旺盛的G2/M期；⑤悬浮组细胞在再次遇到适于贴壁的环境时，能够在没有任何外界刺激的情况下，重新贴壁，并且重新进入细胞周期和旺盛的增殖状态。

2.如权利要求1所述构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，其特征是：所述poly-HEMA的铺板密度为3mg/cm²。

3.如权利要求1所述构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，其特征是：所述接种于抗细胞附着模型或非抗细胞附着模型的细胞密度为4×10⁵个细胞/ml。

4.如权利要求1所述构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，其特征是：所述肝癌体外转移模型鉴定的指标特征中，对悬浮组细胞生长曲线绘制时，细胞培养用CCK8试剂。

5.如权利要求1所述构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，其特征是：所述肝癌体外转移模型鉴定的指标特征中，对悬浮组细胞进行流式细胞仪检测时，细胞应经500目铜网滤过后再上机检测。