[发明专利]一种肌苷片质量的测定方法

说明书

所属领域

本发明涉及一种药物的分析测定方法。具体来说，本发明涉及一种对肌苷片主要有效成分的测定方法。

背景技术

肌苷是人体中的正常成分，参与人体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质合成，活化丙酮酸氧化酶系，提高辅酶A的活性，可使处于低能缺氧状态下的组织细胞继续进行代谢。还可改善肝脏功能，有助于受损肝细胞功能的恢复，可刺激体内产生抗体，并提高肠道对铁的吸收。

肌苷片是辅酶类药物，有改善肌体代谢作用。用于各种类型肝脏疾患、心脏疾患、白细胞减少症、血小板减少症、中心视网膜炎、视神经萎缩等属于国家基本药物。

药用肌苷是由产肌苷的微生物发酵生成的代谢产物，肌苷产生菌在发酵过程中除产生肌苷(化学名称次黄嘌呤核苷)外还产生次黄嘌呤等肌苷分子的类似物，由于它们结构相似在肌苷片的生产过程中这些类似物很难被除去，因此在肌苷片中含有少量的次黄嘌呤等杂质。而次黄嘌呤与肌苷有共同的紫外吸收结构，因此我国药品部颁标准中所采用的紫外分光光度法测定肌苷片中肌苷含量就难以排除次黄嘌呤等肌苷类似物的干扰。有报道用高压液相色谱法测定肌苷片中肌苷含量，虽分离效果较好但所需设备昂贵、测试成本高难以推广应用。

发明内容

为克服现有分析方法的不足，本发明提供一种肌苷片质量的测定方法，具体是采用酶电极型生物传感器法定量测定肌苷片中肌苷含量，用双酶共固定技术将核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)与黄嘌呤脱氢酶(EC1.2.3.2)制成固定化复合酶膜，结合过氧化氢型电极构成肌苷酶电极生物传感器，用于肌苷片中肌苷的含量测定，从而方便、准确、快速地对肌苷片的质量进行测定。

技术方案

本发明提供的肌苷片质量的测定方法，包括下述顺序的步骤：

1固定化核苷磷酸化酶、黄嘌呤脱氢酶复合酶膜的制备

1.1载体膜圈制备

取直径10mm的核微孔膜片用环氧树脂粘贴在内径9.5mm的橡胶密封圈上，放置过夜使固化完全即得。

1.2载体膜圈表面处理

将载体膜圈置20％甲醇溶液中浸泡15min，取出用蒸馏水冲净、晾干。

1.3固定化复合酶膜制备

取核苷磷酸化酶0.1单位、黄嘌呤脱氢酶0.03单位、20％牛血清白蛋白5μl、2％戊二醛2μl、均匀喷涂在载体膜圈表面，静置固化15min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。将此固定化复合酶膜装在过氧化氢电极头部便构成酶电极。

2固定化肌苷酶膜参数

基础活性＞50，线性：1～270mg/L；各点偏差小于1mg，响应：30s测定值大于60s测定值的90％，膜完整性：亚铁氢化钾测定值-2～6范围内，工作寿命＞25d。

3过氧化氢电极制备

两电极均为长20mm的圆柱体，铂电极表面积4mm²，银电极表面积60mm²，用专用模具置备。两电极之间填充环氧树脂，电极套头端与酶膜圈应嵌合良好，铂电极与酶膜须紧密接触(见图1)，铂电极为正极；银电极为负极。两电极之间极化电压0.65V，酶电极输出电流0～500nA。

4肌苷酶电极生物传感器结构

肌苷酶电极生物传感器由生化反应系统(一次仪表)和电信号处理系统(二次仪表)组成(见图2)。

5测定方法

仪器定标：采用0.1mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，标准液含肌苷268mg/L，取标准液25μl注入反应池60s后仪器自动显示酶膜基础活性，按动定标键(Calibrate)定标268，自动清洗后即可测定样品。

样品制备：取肌苷片5片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于肌苷0.10g)，置100ml量瓶中加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密取续滤液10ml，置50ml量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，即得，进样量25μl。