[发明专利]半滑舌鳎人工催产和雌核发育二倍体鱼苗的诱导方法

权利要求书

1.一种半滑舌鳎亲鱼人工催产和授精方法，其特征在于他的方法包括：(1)亲鱼的选择；(2)催产激素的选择和剂量；(3)人工催产及人工授精；

(1).亲鱼的选择方法：

半滑舌鳎亲鱼为3龄雌鱼和2龄雄鱼，在催产前2-3个月进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5-1℃，从17-19℃逐步升高到22-23℃，并维持在此温度；光照时间按每10天延长1小时，由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时；通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于注射激素进行人工催产；雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，看到精液流出者方可用于催产；

(2)、催产激素的选择和剂量：

半滑舌鳎对几种催产激素较为敏感，如绒毛膜促性腺激素HCG、促黄体素释放激素类似物A2和A3以及地欧酮DOM，其中如下几种激素及其剂量催产效果较好：LRH-A2的适宜剂量为：雌鱼0.5-2.0μg/kg，雄鱼3-6μg/kg；LRH-A3的适宜剂量为：雌鱼0.4-2.0μg/kg，雄鱼2-5μg/kg；HCG+LRH-A3的适宜剂量为：雌鱼HCG40-60 IU+LRH-A3 0.4-1.5μg/kg；LRH-A3+DOM的适宜剂量为：雌鱼LRH-A3 0.4-2.0μg/kg+DOM 1-2mg/kg；

(3).人工催产及人工授精：技术内容包括：A、激素注射；B、效应时间确定；C、人工挤卵和授精；

A、激素注射：

选好亲鱼后，按催产剂量进行激素注射；注射时用MS-222进行麻醉或直接注射，亲鱼从水中捞起后，迅速用大毛巾包住，以防其受伤；激素溶液的注射量雌鱼不要超过1ml/每尾，雄鱼不要超过0.2ml/每尾，注射部位为侧线上方头部后方的肌肉较厚部分，进针角度不要超过45°，雄鱼注射时不要穿透鱼体；

B、效应时间确定：

激素种类不同，注射后的效应时间也不同，各种激素22-23℃时的效应时间如下：LRH-A2：36-44h；LRH-A3：35-43h；HCG+LRH-A3：34-42；LRH-A3+DOM：35-43h；

C、人工挤卵和授精：

到达效应时间以后，当雌鱼性腺明显由硬变软，感觉性腺内的卵有明显的流动感时，即进行挤卵和人工授精；用手在性腺上下两侧从后到前轻压性腺部位，将卵挤出，接在烧杯中；采精时，用手挤压雄鱼腹部，挤出的精液用吸管吸到2-5毫升的小瓶中备用；当进行生产性授精时，每条雌鱼产出的卵约100-300毫升，可用2-3条雄鱼的精液约1-2毫升授精；将精卵混合均匀，加入两倍于卵体积的海水，2-3分钟后，再加入5-8倍于卵体积的海水完成受精过程，20min后洗去过多的精液即可转入孵化缸进行孵化；

2.一种半滑舌鳎雌核发育二倍体鱼苗的诱导和鉴定方法，其特征在于他的方法包括：(1)半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法；(2)雌核发育鱼苗的鉴定方法；

(1)、半滑舌鳎卵子人工雌核发育方法：它的技术内容包括：A、精子的遗传灭活；B、未受精卵与失活精子的“授精”；C、雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；D、雌核发育鱼卵染色体加倍冷休克温度及处理时间的确定；

A.精子的遗传灭活：

采用异源的花鲈精子和同源的半滑舌鳎精子刺激半滑舌鳎卵子进行雌核发育；半滑舌鳎精液先用显微镜检查精子活力，当活力达到60％以上者可用于紫外线灭活处理；精子的遗传灭活条件为：将100μL半滑舌鳎精液用精子稀释液MPRS稀释10倍，平铺于培养皿中，用90-110mJ/cm²紫外线照射，然后与5-10mL半滑舌鳎卵“授精”；异源精子为冷冻保存的花鲈精子，从液氮中取出花鲈冷冻精子，在37℃水浴复温解冻后镜检精子活力，活力达到60％以上者用于紫外线灭活处理；将100μL解冻的花鲈精液用1mL MPRS溶液稀释后，平铺于培养皿中，用90-110mJ/cm²紫外线照射，然后与5-10mL半滑舌鳎卵受精，在22-23℃恒温培育；

B.未受精卵与失活精子的“授精”：

经紫外线照射后的精液200-1000μL加到10-100毫升半滑舌鳎未受精卵中，将精卵轻轻摇动混匀，随后加入2-10毫升海水，继续混匀后，再加入20-200毫升海水完成“授精”过程，在22-23℃下培育2-6分钟，准备用于染色体加倍处理；

C.雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定：

染色体加倍采用冷休克处理方法，在“授精”后2，3，4，5，6，7，8min，将卵倒入直径为10-15厘米的小抄网，将盛有雌核发育卵的小抄网浸入3-6℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为20-30min，冷休克处理完毕后将卵移入23℃海水中培养；统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率；结果表明在授精后4-6min中都能够诱导产生雌核发育二倍体，且以授精后5min的诱导率最高；

D.染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选：

在确定了冷休克起始时间后，需要确定冷休克温度和休克持续时间；将与紫外失活精子“授精”的卵，分成6个温度梯度2℃，4℃，5℃，6℃，8℃和10℃，在每个温度梯度分别处理15min，20min，25min，30min，35min，40min；最后统计受精率，单倍体率，雌核发育二倍体率；结果表明在休克温度3℃-6℃，休克时间15min-30min条件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在4.5-5.5℃处理20-25min的雌核发育诱导率最高；

(2)、雌核发育鱼苗的鉴定方法：它的技术内容包括：A.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗；B.通过微卫星分子标记鉴定雌核发育鱼苗；C.通过半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗；

A.染色体分析鉴定雌核发育鱼苗：采用常规染色体制片方法，对半滑舌鳎雌核发育鱼苗进行染色体分析，发现半滑舌鳎雌核发育鱼苗的染色体数为42条，与普通半滑舌鳎鱼染色体数目完全相同；同时我们还发现有些雌核发育鱼苗含有2条巨型WW染色体，这些鱼苗是雌核发育的WW型鱼苗；由此充分证明这些鱼苗为雌核发育二倍体个体；

B.用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗：

采取高盐法提取雌核发育鱼和正常鱼苗基因组DNA，从我们筛选到的半滑舌鳎多态性微卫星引物中，选取微卫星引物Cyse31，其引物序列为：Cyse31N1：GACGGTCAAAAGTGGTGTGA；Cyse31C1：TTTCCACTGTTCACCTGCTG.然后进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃热变性5min，然后进行38个循环，每个循环包括94℃变性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；PCR扩增产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，采用银染法染色；结果表明该引物对在半滑舌鳎普通鱼苗中扩增出具有2个等位基因的杂合子的比例为55.6％，而在25尾雌核发育鱼苗中，有20尾只扩增出1个等位基因，仅有5个个体扩增出2个等位基因，杂合率仅为20％，并且在所有检测的雌核发育鱼苗中仅出现2个等位基因，由此证明这些鱼苗是雌核发育而来；

C.用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记鉴定雌核发育鱼苗：

采用半滑舌鳎雌性特异AFLP标记和遗传性别鉴定的PCR技术进行半滑舌鳎雌核发育鱼苗遗传性别的鉴定；其技术原理为含有W染色体的雌性个体中可以扩增出雌性特异DNA片段，不含W染色体的ZZ雄性个体则没有这种特异DNA片段；采用序列为ATTCACTGACCCCTGAGAGC的特异引物Cse382N1和序列为GTAAACAGCACACACTCAACAA的特异引物Cse382C1，利用高盐法提取半滑舌鳎雌核发育鱼苗个体DNA作为模板，进行PCR扩增；PCR反应体系为25.0μl，包括：2.5μl 10×PCR缓冲液，1.0μl 2.5mMdNTP，2.0μl 10pM引物混合液，基因组DNA 0.8-1.5μl，双蒸水16.3-17μl，5U/μl的Taq酶0.2μl；PCR扩增条件为95℃预变性5分钟，然后95℃30秒、66℃30秒、72℃1分钟，35个循环，最后在72℃延伸10分钟，采用1％琼脂糖电泳分析PCR产物；从10尾异精雌核发育半滑舌鳎鱼苗中检测到4尾鱼苗含有382bp的雌性特异DNA片段，表明我们获得的半滑舌鳎雌核发育鱼苗中含有40％左右的超雌鱼苗。