[发明专利]裸子植物花粉管微管骨架的免疫荧光标记方法及其应用

权利要求书

1、一种对裸子植物花粉管微管骨架进行免疫荧光标记的方法，包括以下步骤：

1)将裸子植物花粉管用浓度为3-5g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液的固定液固定40-60min；

2)洗涤花粉管；

3)将花粉管置于浓度为0.5-1.2g果胶酶和纤维素酶/100ml水的酶溶液中，在20-30℃下酶解30-40min；

4)洗涤花粉管；

5)将花粉管置于体积/体积百分比浓度为0.5-1％的Triton X-100中渗透1-3h；

6)洗涤花粉管；

7)加入作为一抗的抗β-tubulin单克隆抗体孵育1-3h；

8)洗涤花粉管；

9)加入与一抗特异结合的荧光标记的二抗避光孵育1-3h，微管骨架被免疫荧光标记。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的固定液的浓度为4g多聚甲醛/100ml 40-60mM Pipes缓冲液，固定时间为60min。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中果胶酶和纤维素酶液的浓度为1g果胶酶和纤维素酶/100ml水；所述果胶酶和纤维素酶液中的果胶酶和纤维素酶的重量份数比为1∶0.5-2；酶解温度为25℃，酶解时间为40min。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5)中的渗透剂为1％的Triton X-100，渗透时间为1.5h。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤7)中的抗β-tubulin单克隆抗体为Sigma公司的抗β-tubulin的单克隆抗体；所述抗β-tubulin单克隆抗体溶液的工作浓度为1∶50-150比例的稀释液。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤9)中二抗的荧光标记为FITC标记、TRITC标记、Alexa 488、Cy2、Cy3、Rhodamine B或Texas Red标记；所述二抗溶液的工作浓度为1∶50-150比例的稀释液；所述孵育时间为1h。

7、根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2)、步骤4)、步骤6)和步骤)8中的洗涤液均为40-60mM Pipes缓冲液。

8、根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述裸子植物为松杉纲、银杏纲或苏铁纲植物；所述松杉纲植物为松科的白杆、青杆、油松、云杉或冷杉；所述银杏纲植物为银杏；所述苏铁纲植物为苏铁。

9、一种对裸子植物花粉管微管骨架进行显微镜观测的方法，是先用权利要求1-7所述的任一项方法对裸子植物花粉管微管骨架荧光标记，然后滴加含质量百分含量0.15-0.25％抗荧光淬灭剂的浓度为40-60％的甘油，封片，最后用激光共聚焦显微镜对花粉管微管骨架进行观测。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述抗荧光淬灭剂为Propylgallate、Vectashield或Fenyleen diamine。