[发明专利]一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法

权利要求书

1.一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)灭菌：花蕾用60-80％酒精灭菌20-40秒，再用含1-3％有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌10-20分钟；在用无菌水冲洗2-4次，每次2-6分钟；

(2)花药预处理：在无菌条件下取出花药，接种在B₅-13(含13％蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4℃低温条件下低温培养2-4天；

(3)分离小孢子：将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用B₅-13培养基洗涤2-4次，每次2-4分钟；

(4)小孢子培养：将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为1～2×10⁵个/ml，25℃暗培养10-20天；培养中的小孢子经32-35℃热激24小时后，于25℃进行暗培养，直至长出胚状体。

2.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于：所述(1)灭菌：花蕾用70％酒精灭菌30秒，再用含2％有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌15分钟；在用无菌水冲洗3次，每次5分钟。

3.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于：所述(2)花药预处理：在无菌条件下取出花药，接种在B₅-13(含13％蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4℃低温条件下低温培养3天。

4.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于：所述(3)分离小孢子：将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用B₅-13培养基洗涤3次，每次3分钟。

5.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于：所述(4)小孢子培养：将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为1～2×10⁵个/ml，25℃暗培养15天，；培养中的小孢子经33℃热激24小时后，于25℃进行暗培养，直至长出胚状体。