[发明专利]一种检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸，包括样品垫、紧密连接于所述样品垫一端的含有金黄色葡萄球菌蛋白A标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫的另一端紧密连接的硝酸纤维膜和紧密连接于所述硝酸纤维膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有嗜肺军团菌抗原，所述质控线含有能与所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体；

所述检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

1)制备嗜肺军团菌抗原，将嗜肺军团菌抗原溶液喷到纤维素膜上形成检测线，将能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体溶液喷到所述纤维膜的另一区域形成质控线，然后将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离所述测试带的一端；

2)制备金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，将其粘贴在步骤1)得到的纤维素膜的靠近所述检测线的一端；

3)将在步骤2)中得到的金标垫上远离所述检测线的一端粘贴样品垫，得到检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸；

所述步骤1)中的嗜肺军团菌抗原为嗜肺军团菌血清1、4、5和6型的混合抗原；所述金黄色葡萄球菌蛋白A特异性抗体为以金黄色葡萄球菌蛋白A为抗原免疫动物得到的抗体，所述免疫动物为羊、兔、猴、鸡或鼠；所述检测线含有1、4、5、6血清型的嗜肺军团菌抗原的浓度分别为2mg/mL、1mg/mL、3mg/mL和2.5mg/mL，所述质控线含有的能与金黄色葡萄球菌蛋白A特异结合的抗体的浓度为3-5mg/mL；

所述步骤1)中的嗜肺军团菌抗原的制备方法为：a.将嗜肺军团菌接种在BCYE平板上，在37℃、5％CO₂孵箱中培养3-5天，挑取在平板上长出的典型的单个菌落，将其转种至BCYE斜面，在37℃、5％CO₂孵箱中培养3-5天，将培养的斜面用无菌0.01M、pH 7.2的PBS洗下菌苔，离心，弃上清，收集菌体沉淀；b.将每克湿重菌体悬浮于10mL 0.1M NaOH中，室温搅拌1小时；c.用浓醋酸调溶液pH至3.0，离心，弃沉淀，将上清用5N NaOH调至pH 6.5-7.0；d.所得溶液用0.01M、pH 7.0的PBS透析48小时，得到嗜肺军团菌抗原；

所述步骤2)中金黄色葡萄球菌蛋白A标记的免疫胶体金探针溶液的制备方法包括以下步骤：

A.将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸，搅动下准确加入1.6mL的1％二水合柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色， 得到胶体金溶液，冷却后用水恢复至原体积；

B.将步骤A获得的胶体金溶液的pH值调至8.5-9.5，每100mL胶体金溶液加入终浓度为12μg/mL的金黄色葡萄球菌蛋白A，搅拌25-35分钟，加入5mL 10％ BSA，搅拌20-30分钟，再加入1mL 10％ PEG20000，搅拌20-30分钟，先在20,000-23,500rpm下离心25-35分钟，弃上清，用0.05-0.1M的四硼酸钠溶液洗涤沉淀，并将其保存于8-10mL 0.05-0.1M的四硼酸钠溶液中，得到嗜金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金探针溶液。

2.根据权利要求1所述的检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸，其特征在于：所述检测嗜肺军团菌抗体的免疫层析试纸的背面紧密连接一背板。