[发明专利]一种萤火虫荧光素酶基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的萤火虫荧光素酶基因，特别涉及该基因在生产萤火虫荧光素酶中的应用。

背景技术

萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂，它在ATP、Mg²⁺和O₂存在的条件下，以荧光素为作用底物，进行氧化反应，化学反应如下：荧光素+ATP+O₂＝氧化荧光素+AMP+PPi+CO₂+光。该反应的量子产率约为0.88。在有过量底物和过量酶存在的情况下，发射光强度与反应系统中的ATP成正比，因此这种发光特性使得萤火虫荧光素酶能够在各种各样的测定ATP的研究和生产中广泛应用。

Jeffrey等1985年曾构建了含虫光素酶基因的重组载体pkw101。Matuda等也构建了含虫光素酶基因的重组体。并进而获得了能产生虫光素酶的重组大肠杆菌菌株。但是，利用Jeffrey构建的重组载体pkw101生产萤火虫荧光素酶，在细菌的培养过程中，要经过45℃热诱导30分钟的处理，再转到37℃培养才能产酶，影响酶的稳定性；利用Matuda构建的重组体生产萤火虫荧光素酶，存在提取虫荧光素酶的方法繁琐、工艺复杂的缺点。1989年日本专利(PCT/JP89/00811)的申请者曾从海洋甲壳类动物中获得荧光素酶基因，并构建了重组体DNA，但在大肠杆菌培养过程中仍存在同样的问题，1993年金振华等构建了具有分泌信号肽的虫荧光素酶重组DNA，可以分泌到周质空间，但当菌体破碎后，虫荧光素酶的纯化同样存在着分离困难，纯度低、得率低，酶活损失严重等问题(专利号：93117156)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的突变萤火虫荧光素酶基因。

本发明所提供的突变萤火虫荧光素酶基因(mutLuc)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

序列表中的序列1由1671个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列是自序列1的5’末端的第1-1671位核苷酸，编码序列表中序列2的萤火虫荧光素酶。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在pQE-30(Qiagen公司)的BamHI和SacI位点间插入序列表中序列1的自5’末端第1-1671位脱氧核糖核苷酸得到的pQE-mutLuc。

在pQE-mutLuc中，由于萤火虫荧光素酶基因处于高效启动子PT5及乳糖操纵子LacO的控制之下，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，本发明的萤火虫荧光素酶基因能被高效诱导转录，并且转录得到的mRNA含有核糖体结合位点RBS；同时本发明对Luc基因密码子进行了优化，使得萤火虫荧光素酶转录本得到高效翻译，显著提高萤火虫荧光素酶的产量。

本发明的另一个目的是提供一种生产萤火虫荧光素酶的方法。

本发明所提供的生产萤火虫荧光素酶的方法，是将上述任一种重组表达载体导入宿主细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。

所述宿主细胞具体可为大肠杆菌，因大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的无毒肠道杆菌，革兰氏阴性，可在LB固体或液体培养基中37℃培养，生长迅速。本发明中所使用的大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物技术公司)。

培养含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌，能在含有蛋白胨、酵母粉的培基中迅速生长，菌体产量高，易于培养。

本发明利用大肠杆菌的偏爱密码子，优化了萤火虫荧光素酶基因，并利用该优化基因构建了重组表达载体pQE-mutLuc，将pQE-mutLuc导入大肠杆菌得到工程菌，利用该工程菌生产萤火虫荧光素酶的方法，与目前现有的萤火虫荧光素酶生产方法相比，本方法具有产品易纯化，得率高(每升发酵菌液中的酶蛋白大于2mg)，酶的纯度高(酶的比活力≥2.2×10¹⁰RLU/mg蛋白)，纯化速度快，可在30分钟以内完成，酶活保持好，是一种高效的生产萤火虫荧光素酶的方法，适于工业生产中应用。

附图说明

图1为本发明中重组表达载体pQE-mutLuc结构示意图。

mutLuc：本发明的萤火虫荧光素酶基因；ampR：抗氨苄青霉素；PT5：T5启动子；LacO：LacZ操纵子；RBS：核糖体结合位点；ColE1：ColE1复制起始位点。

图2为本发明中的工程菌株pQE-mutLuc-E1在IPTG诱导和未诱导条件下的菌体生长曲线。