[发明专利]一种石油烃降解菌的高密度发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是一种石油烃降解菌的高密度发酵方法。

背景技术

生物修复技术是石油及相关产品污染土壤的主要修复技术。由于石油污染物具有组成复杂、生物难降解和具有较低的生物可利用度等特点，土著微生物难以有效的、快速的、彻底的降解土壤中的石油烃。生物添加法可通过添加具有高效降解石油烃能力的微生物提高生物修复的效率，有效的去除石油烃污染物。然而对于大规模石油污染土壤的治理或者石油污染的突然事故的治理，会带来高效降解石油烃能力的微生物的大量需求，因此采用高密度发酵生产石油烃降解菌的工艺开发显得尤为迫切。2006年中科院成都生物所的科研人员承担了国家“863”计划水污染控制技术与治理工程重大专项中的两个课题——高效优良菌种选育及处理系统中微生物种群的优化调控和高效厌氧和好氧生物反应器研制与应用(试剂与精细化学品.2006(2).-3-3)。只是仅仅提及石油和印染废水为主的多个品系菌剂及其高密度发酵，没有具体发酵工艺路线，没有具体产量。国外未发现相关报道。目前对于小规模的工程实施，试验过程中施加的细菌菌剂普遍是在实验室摇瓶直接培养，然后把菌剂运到试验现场施加。一方面，无法满足更大规模工业实施的在短时间内生产出大量菌剂量的要求；另一方面，增加了生物治理的成本，降低了生物治理的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石油烃降解菌的高密度发酵方法，其特征在于，该方法是利用高密度发酵生产石油烃降解菌的方法，经过斜面菌种活化、扩大培养制备种子液、接种前准备及接种、分批补料发酵培养，调控菌体平均生长速率，以高密度发酵生产石油烃降解菌。该方法成本低，操作简单，能在短时间产生大量石油烃降解菌，解决了大规模石油污染土壤治理和石油污染突然事故的治理的菌种问题。

该制备方法包括如下工艺步骤：

(1)将斜面菌种经平板LB培养基培养活化、制备发酵种子液；

(2)将步骤(1)中制备的种子液按发酵培养基体积的5-6％比例接种于发酵培养基进行发酵，包括发酵前准备和接种。其中分批发酵培养基和补料发酵培养基包括表1所示的组分(g/L)：

表1分批发酵培养基和补料发酵培养基组分

  成分  分批发酵培养基，g/L  补料培养基，g/L  葡萄糖  酵母粉  K₂HPO₄  NaH₂PO₄  (NH₄)₂SO₄  MgSO₄·7H₂O  EDTA  微量元素  30.0  50.0  8.7  4.2  5.5  2.5  1  1ml  1000.0  400.0  26.0  12.6  16.5  20  3  3ml

培养温度为32～37℃，将菌体平均生长速率控制在0.2-0.4h^-1；

发酵过程中pH值控制在6.8，并进行补料，控制补料速率与菌体的消耗速率相当，发酵完毕，收集发酵液，加甘油保存。发酵周期为12-14小时；

(3)采用分批-补料培养方式，对补料前pH、溶氧控制；

(4)补料阶段

①流加葡萄糖溶液：在发酵过程中，C源耗尽时，即溶氧水平DO徒然上升，pH徒然上升，流加葡萄糖溶液，给发酵罐中补入浓度为1000g/L的葡萄糖溶液使得发酵罐内葡萄糖浓度控制在0.2-0.5g/L范围内；

②流加含有发酵无机盐和微量元素的酵母溶液：N源耗尽时，即溶氧水平D0徒然上升，pH徒然下降，流加含有发酵无机盐和微量元素的酵母溶液；