[发明专利]一种利用间充质干细胞联合细胞因子培养破骨细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于破骨细胞的培养方法，具体地说涉及一种利用间充质干细胞联合细胞因子培养破骨细胞的方法。

背景技术

破骨细胞(osteoclasts，OC)是人和动物体内吸收骨组织的主要细胞，在生理情况下，破骨细胞与成骨细胞相互协助，参与贯穿生命全过程的骨质重建活动，维持骨骼系统的动态平衡；在肿瘤、炎症、骨质疏松症和自身免疫性疾病等病理情况下，破骨细胞参与疾病的发生、进展，影响疾病的转归和预后。

破骨细胞由造血干细胞分化发育而来，在体内可以分解骨组织，在体外培养的破骨细胞可以在骨片、象牙或者人工骨组织培养上形成吸收性陷窝，成熟时变为含有多个细胞核的巨大细胞，破骨细胞的主要特征为呈特异性的抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP+)组化阳性，以及F-actin染色阳性，表达降钙素受体、组蛋白酶K(cathepsin-k)、整合素αvβ3(integrinsαvβ3)等(Walsh MC等，AnnuRev Immunol.2006；24：33-63)。

在体外培养破骨细胞是研究多种激素、细胞因子与破骨细胞和骨吸收关系的基础，也是研究肿瘤、炎症、骨质疏松症和自身免疫性疾病发病机制和药物治疗方法的基础。近年来，根据从破骨细胞研究中获得的发现，人们使用其调控因子作为动员剂，作为造血干细胞移植前采集造血干细胞的手段之一(KolletO，Nat Med.2006 Jun；12(6)：657-64.Epub 2006 May 21)；开发出了破骨细胞分泌因子的抗体、拮抗剂和抑制剂，用于治疗骨疾病如骨质疏松症和癌症如恶性肿瘤转移(Abe M等，Leukemia.2006 Jul；20(7)：1313-5.Epub 2006 Apr 13)；将破骨细胞引入组织工程领域，将其与成骨细胞共同种植于生物材料上，改善组织工程化骨的三维结构等等(韩大庆等天津生物医学工程2006学术年会论文摘要)。综上所述，建立破骨细胞的体外培养方法，深入研究破骨细胞的发育、分化、成熟和发挥功能的规律以及其分子调控机制，有利于寻找造血、自身免疫疾病、肿瘤和骨代谢疾病方面新的诊断技术和治疗药物。

到目前为止，培养破骨细胞的方法(吕明波等国际骨科学杂志，2006年9月，第27卷，第5期)主要有：(1)、成熟破骨细胞分离培养法1984年Chamber等率先从兔子四肢长骨中原代分离出了破骨细胞，然而，破骨细胞在动物体内数量少、体积大、紧贴骨髓腔内表面生长、胞体分离时容易损伤，分离后不易培养；另外，分离法获得的是终末期破骨细胞，难以用于进行生长、增殖和分化方面的研究；(2)、骨巨细胞瘤破骨细胞分离法骨巨细胞瘤是一种以溶骨性骨破坏为特征的骨肿瘤，Zambonin-Zallon A等从骨巨细胞瘤瘤体中分离出大量的破骨细胞。不过，骨巨细胞瘤发病率低，组织来源少，无法长期稳定提供破骨细胞来源；并且，该法获得的破骨细胞具有肿瘤相关特性，与正常破骨细胞还有区别，不能作为常规细胞来源；(3)、骨髓诱导培养法Burger等报道用骨髓加各种诱导剂(维生素D3、白介素6、肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、地塞米松等等)来诱导培养出破骨细胞。该法采用骨髓细胞作为培养细胞，在一定程度上可以模拟骨髓微环境对破骨细胞分化发育的影响。但是，该方法所用的骨髓实际包括内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种成份，不利于开展精确的发育调控机制的研究，另外，骨髓细胞的获得需剥离动物肌肉，分离出长骨，然后反复冲洗骨髓，操作费时费力；(4)、外周血单核细胞培养法Fujikawa等用人的外周血分离出单核细胞，然后诱导培养，获得破骨细胞。但是，外周血中造血干祖细胞细胞数目极少，而造血干祖细胞是破骨细胞的早期发育来源，该法仅用单核细胞进行培养，破骨细胞的获得效率较低；(5)、脾脏细胞诱导培养法是目前常用的破骨细胞培养方法。Udagawa首先用大鼠脾细胞培养获得大量的破骨细胞并证实具有骨吸收能力。与骨髓细胞培养法相比，脾脏细胞诱导培养法取材方便，打开动物腹部即可摘除脾脏，而无须经剥离肌肉，分离多根长骨，反复多次冲洗骨髓；而且排除了骨髓中复杂的细胞环境的影响；鼠类等脾脏具有终身造血能力，脾脏内存在着造血干细胞，采用脾脏细胞比采用单核细胞具有更好的生长增殖潜力。建立一种稳定实用、经济简便、高效的破骨细胞培养方法是开展破骨细胞相关研究的迫切需要。