[发明专利]一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法，在采用小球藻生产重要生命活性物质叶黄素方面具有重要的应用价值和前景。

背景技术

叶黄素属于一种不对称的二羟基类胡萝卜素，是人眼视网膜中黄斑色素的主要组成成分。目前研究发现叶黄素主要有以下三个方面的医药价值：1)防止老年人视黄斑退化；2)具有抗癌作用；3)对心脑血管疾病有防治作用。另外，叶黄素作为高价值的纯天然色素，可以广泛应用于食品着色、化妆品和医药等行业中。目前叶黄素的价格与黄金价格基本相当，有食物黄金的美称，其国内市场年需求达10万吨，但生产量仅6千吨，远远满足不了国内外市场的需要，因此具有广阔的市场潜力。

目前，叶黄素的化学合成技术尚未取得成功，因此只能主要从万寿菊等植物中提取提纯得到。叶黄素生产工艺是首先将万寿菊青贮、压榨、干燥制粒，然后采用正己烷提取和蒸馏后获得。因为万寿菊生长缓慢，因此研究生长速度快和叶黄素含量高的其它生物物种来取代万寿菊作为生产叶黄素的生物资源已经成为一个非常重要的研究课题。我们研究发现小球藻细胞中叶黄素含量基本与万寿菊中的叶黄素含量相当，特别是我们采用异养发酵方法培养超高细胞浓度小球藻的技术已经成熟，可以快速培养出大量的小球藻生物量。因此采用小球藻作为一种生产叶黄素的生物资源以替代万寿菊是完全可能的。

国内外学者在从万寿菊中提取叶黄素的优化控制方法方面进行了大量的研究，但在从小球藻中如何高效提取并纯化叶黄素方面的研究报道却不多见。小球藻中的叶黄素经过有机溶剂的萃取后，大部分是以酯类性形式存在的。由于叶黄素的水溶性非常差，叶黄素酯类衍生物不能被人体直接吸收代谢，不能发挥药用价值，叶黄素酯在人体内酶的作用下，水解为游离态叶黄素，继而被吸收参与代谢。该方面的转化研究集中于将叶黄素酯置于碱性环境中，通过皂化反应得到游离态叶黄素。目前，主要的皂化方法有两种，一种是冷皂化，即在提取的叶黄素酯中按照预定比例加入碱溶液，搅拌后反应过夜。另一种是热皂化，与冷皂化不同的地方是对加入碱液后的混合溶液加热直至反应结束。常用皂化剂为40％氢氧化钾甲醇溶液或饱和的氢氧化钠溶液。经皂化后，得到的皂化品中仍存在着部分酯溶性杂质，因此还要做进一步纯化处理。

在成功筛选出能够异养生长小球藻种并通过优化培养控制获得超高细胞浓度小球藻的基础上，我们在选择冷皂化、热皂化和最佳皂化条件从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素方面进行了比较系统和全面的研究，发现采用热皂化利用20％的氢氧化钠水溶液可以从藻粉中高效地将叶黄素酯转化为叶黄素，这为进一步采用小球藻生产叶黄素奠定了非常重要的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从小球藻藻粉中提取纯化叶黄素的方法，采用一种小分子量的极性有机溶剂乙醇和一种非极性试剂正己烷进行混合作为提取剂，20％氢氧化钠溶液作为皂化剂，通过进一步纯化处理，可以高效地将小球藻藻粉中叶黄素酯类转化为叶黄素，提取量达到3.2mg/g。实现了从小球藻细胞中高效地将叶黄素酯转化为叶黄素的皂化工艺。为采用异养发酵培养小球藻生产叶黄素的产业化生产奠定基础。

本发明先利用混合试剂进行叶黄素及其酯类的提取，然后用5～30％的氢氧化钠进行皂化。经旋转蒸发，洗涤，结晶后获得较高纯度叶黄素晶体。从小球藻藻粉中提取叶黄素工艺为：称取0.2～2g藻粉放入50～500ml离心管中，加入8.0～80.0ml混合液体溶剂进行提取，温度为10～40℃，时间为0.5～2小时。皂化工艺为：向加入混合提取剂的试管中加入10～100ml的5～30％氢氧化钠水溶液，30～70℃皂化3～8小时，低温离心5～10分钟，有机相中获得从藻粉中提取出的叶黄素。

本发明所述的混合液体溶剂为极性溶剂乙醇，非极性溶剂正己烷；二者溶剂中的碳原子和氧原子比值20∶1。

1、不同皂化剂对小球藻藻粉中叶黄素酯转化的效果：向50～500ml离心管中加入0.2～2g藻粉，在加入混合提取剂提取后，分别向离心管中加入10～100ml的5～30％氢氧化钠溶液、氢氧化钠-水-乙醇溶液或氢氧化钠-水-甲醇溶液，30～70℃皂化3～8小时，提取溶剂上清液直接在高压液相色谱上测定叶黄素浓度，以确定不同皂化剂对藻粉中叶黄素酯转化的效果。研究结果显示，在测试的不同溶剂中，氢氧化钠溶液作为皂化剂时上层有机相中的叶黄素浓度最高，皂化效果最好。