[发明专利]一种提高重组蛋白分泌效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种提高重组蛋白分泌效率的方法。

背景技术

人类利用DNA重组技术生产治疗性药用蛋白已有数十年的历史了。目前人们主要采用原核的细菌表达系统以及真核的酵母和哺乳动物细胞表达系统来生产重组药用蛋白。细菌生长速度快，对其做遗传修饰相对较容易些，尤其是在工业化生产上成本要远低于哺乳动物细胞规模化培养系统。但是细菌表达系统由于其本身固有的一些缺陷，使其难以表达一些来源于高等真核生物的复杂蛋白。其中一个主要的原因是细菌缺乏完善的翻译后修饰系统，容易使表达的重组蛋白形成不正确的折叠构象以及缺少糖基化和乙酰化修饰，最终失去天然活性。哺乳动物细胞表达系统可以有效克服细菌表达系统这些不足之处，但是在细胞规模化培养成本和重组蛋白产量上却难以与细菌表达系统相抗衡。虽然人们对提高哺乳动物细胞表达产量做了许多优化工作，在一定限度上提高了产量，但是最终产量还是与细菌表达系统相差甚远(Wurm2004)。一种行之有效的提高产量的方法就是利用动物乳腺作为生物反应器。乳腺生物反应器具有高产量(1-20克/升)、低成本(转基因动物技术的成本是哺乳动物细胞培养技术的1/100-1/10)和无病原污染等优点。制备转基因动物乳腺生物反应器的一般流程为：构建乳腺特异表达载体，制备转基因小鼠验证乳腺表达载体在动物乳腺中表达重组外源蛋白的效果，然后制备转基因大家畜以大规模生产重组外源蛋白，最终从乳汁中分离纯化目的蛋白。由于重组蛋白分泌到乳汁中，与表达于哺乳动物细胞内的蛋白相比，其分离纯化工艺要相对简单(Hennighausen 1990；Clark 1998；Van Cott and Velander 1998)。2006年一种商品名为ATyn，来自于转基因动物的抗血栓重组蛋白药物被欧洲药品管理局批准上市，标志着转基因动物用于商业化生产药物时代的到来。

对于如何提高重组蛋白在哺乳动物细胞以及转基因动物中的产量，人们已经做了大量的优化工作。这些工作主要集中转录和翻译水平上的修饰，例如选用较强的启动子，添加增强子和绝缘子，优化密码子，以及添加内含子等遗传修饰(Fiering，Whitelaw et al.2000；Lee and Young 2000；Zhang，Wu etal.2005)。但是关于提高重组蛋白分泌效率的研究工作相对较少，尤其是对转基因动物的分泌效率研究更少。

分泌性蛋白通常在其N端含有一段16-26个氨基酸长的信号肽序列，信号肽具有明显的序列特征，它包括N端起始的蛋氨酸(甲硫氨酸)、带正电荷的氨基端区、高度疏水的中央核心区以及具有极性的羧基区。牛β酪蛋白信号肽具有上述的所有特征，此外它的疏水核心区中亮氨酸与丙氨酸含量比例为4∶2，研究表明当疏水核心区中亮氨酸与丙氨酸含量比例在7∶3到2∶8范围内信号肽都具有正常的分泌功能，在有效的比例范围内提高亮氨酸的含量可以促进疏水螺旋二级结构的形成，从而提高其分泌效率，牛β酪蛋白信号肽具有较高的亮氨酸/丙氨酸比值，因此被认为是个具有较好分泌功能的信号肽(Izard，Doughty et al.1995)。信号肽引导翻译中的新生肽进入内质网腔，并进行折叠和乙酰化、磷酸化等各种修饰，然后转运至高尔基进一步作糖基化加工，最后以膜泡形式运送到胞外(Walter，Gilmore et al.1984；Rapoport，Jungnickel et al.1996；Rapoport，Matlack et al.1999)。然而，有一些蛋白，例如转录因子Engrailed，Hoxa5和Pax6，HIV病毒蛋白Tat和疱疹病毒蛋白VP22，以及其它一些蛋白，它们不含信号肽，但仍可以分泌至胞外，这些不依赖信号肽的蛋白分泌形式被称为非经典分泌(Cleves 1997；Brooks，Lebleu etal.2005；Arnoys and Wang 2007；Dupont，Prochiantz et al.2007)。非经典分泌过程中蛋白不经过内质网和高尔基转运，而以一种或几种不明机制直接运输至胞外(Derossi，Calvet et al.1996；Joliot，Trembleau et al.1997；Prochiantz andJoliot 2003)。