[发明专利]用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸高产基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。

背景技术

能源和环保是当今世界面临的重要问题。琥珀酸作为一种生物材料，是最好的石油代替品之一。

琥珀酸(succinic acid)的学名为丁二酸(butanedioic acid)，是线性饱和二元羧酸，可以作为中间化工产品，生成1，4一丁二酯、四氢呋喃、γ-丁内酯和其他四碳化合物。随着催化工艺的发展，琥珀酸还可以转化为更多的化工产品和医药产品，如由琥珀酸氢化生成的丁二醇可以羧化生成己二酸，合成可生物降解的聚合物材料琥珀酸聚丁酸酯(PBS)等，这就使得琥珀酸的市场以平均每年6-10％的速率增长，预计在未来十多年间琥珀酸的世界市场将由1997年的1.5×10⁴吨扩增为大约2.75×10⁶吨。

目前，大部分工业用琥珀酸还是通过化学合成的方法生产，化学合成法生产琥珀酸的原料苯为石油化工产品，并且马来酸酐氢化生成琥珀酸酐再水合生成琥珀酸的转化过程费用高，会造成大量的污染。随着人们环保意识和可持续发展意识的提高，发酵法生产琥珀酸成了新的研究热点。一旦实现了琥珀酸发酵大规模生产，就可以琥珀酸取代石油化工产品苯及基于石化中间品的多种商品，使得在生产和消耗苯及其250种衍生物时引起的污染大大降低。琥珀酸发酵消耗1mol葡萄糖的同时固定1mol CO₂，消耗了温室效应气体，因此，发酵法生产的琥珀酸将是一种很好的绿色平台化学品。然而，采用一般厌氧瘤胃菌株发酵琥珀酸难度大，底物转化率低，产品价格偏高，因此，迫切需要寻找或构建一种能代谢多种廉价碳源，发酵条件简单，琥珀酸高产的新菌株。

与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，琥珀酸发酵研究起步较晚，文献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、琥珀酸等。但是，琥珀酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化碳水平下，产琥珀酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产琥珀酸放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高CO₂浓度的条件下进行发酵才以琥珀酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌株本身有多条琥珀酸生产途径，具有代谢灵活性，易于改造。对大肠杆菌琥珀酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸发酵中，琥珀酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该途径产生1摩尔琥珀酸伴随着1摩尔二氧化碳的固定。该途径的关键反应是将三碳中间物：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为四碳化合物：草酰乙酸(OAA)。草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合酶生成富马酸，最后由富马酸裂解酶生成琥珀酸。大肠杆菌中催化PEP羧化的酶是PEP羧化酶(PEPC，Ppc)。同时，在某些情况下，乙醛酸旁路及其它分枝代谢途径也参与到琥珀酸代谢中，使琥珀酸的产生更具灵活性。PEP羧化酶催化反应分为三步(如图1)，自由能为-30KJmol^-1，反应是不可逆的。第一步反应为碳酸氢根和PEP反应生成carboxyphosphate和enolate，第二步反应为催化第一步产物生成磷酸根、二氧化碳和enolate，第三步反应为催化二氧化碳和enolate生成OAA。可以看出，最初二氧化碳的固定形式是碳酸氢根离子，并且反应同化了1摩尔二氧化碳。碳酸酐酶(CA：carbonicanhydrase)催化二氧化碳形成碳酸氢根的形式，这预示着在大肠杆菌体内扩增碳酸苷酶将有助于提高二氧化碳的固定速率，有利于增加三羧酸循环的碳流供应，有利于提高琥珀酸的产量。