[发明专利]中肋骨条藻细胞色素b基因的RFQ－PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种浮游硅藻的检测方法，特别涉及一种中肋骨条藻细胞色素b基因的RFQ-PCR检测方法。

背景技术

中肋骨条藻(S.costatum)为多个细胞的长链，细胞为透镜形成圆柱形，直径6～7微米，壳缘刺8～30条，胞间隙一般较细胞长度大。色素体通常2个，位于壳面。核在中央。中肋骨条藻是广温广盐的典型代表，分布极广，从北极到赤道，从外海高盐水到沿海低盐水团，甚至半咸水中皆有，但以沿岸最多。个体生态学研究指出，中肋骨条藻具有高生长率和硝酸盐吸收速率，因此比其他很多硅藻种类更能适应高温和低盐的环境(Curl et al.，1961；Jorgensen，1968；DeManche et al.，1979；Collos，1992，1997；Lomas et al.，2000)，使得中肋骨条藻在富营养中比其他很多硅藻更具竞争力。栖息于渤海湾的中肋骨条藻，其种群的最适温度为20～26℃，盐度25～30，其数量一般以冬春之交和夏秋之交为高峰期(Zou et 1.，1983)。在大连湾，中肋骨条藻多在夏末秋初形成优势种，并引发赤潮，发生赤潮时，细胞密度为4.3×10³～7.2×10⁵个mL^-1(Wang et al.，1991)。长江口处于赤潮临界状态的中肋骨条藻密度为7×106个m-3，约占浮游植物总量的96％(Hong et al.，1992)。我国的南海珠江口，闽南九龙江口，闽东闽江口，咸淡水汇合处，一般其它硅藻生长不良，本种特别繁茂，每升水中可达2～4百万个细胞。

中肋骨条藻是海洋次级生产者如牡蛎的优良饵料。另一方面，中肋骨条藻又是我国近海常见的赤潮生物，在经济海藻养殖区，常与海带、紫菜等争夺营养，该种的大量水华可引起经济藻类变色，甚至腐烂而失去食用和商业价值。在赤潮前后，海区内藻类的多样性具有很大差异，中肋骨条藻的密度急剧上升，其它藻类数量迅速减少，种群结构变得很简单，并认为藻类密度和种群结构的动态变化对赤潮的对赤潮预报具有重要价值。因此，及时、准确、快速地检测中肋骨条藻，了解其在养殖区的动态，当其数量增加时及时控制，这对海洋养殖业具有重要意义。

传统的中肋骨条藻的生长率测定方法有稀释培养法和生物化学指示物法等。这些方法需要在现场采集水样后进行梯度稀释或加入C同位素后培养一段时间(一般为24小时)，计算细胞的增长量来估算生长率。稀释培养的方法会受细胞死亡和浮游动物捕食的影响；加入C同位素的方法提供的是全部浮游植物种群的生长率，无法提供某一特定种浮游植物的生长率，并且都要采样进行现场培养，在培养过程中会出现“培养瓶效应”(Williams eta1.，1989)不可避免的会引入样品沾污和细胞死亡，并会受浮游动物捕食的影响。

整体来说，国际上在该领域的研究仍处于起步阶段，有待于进一步发展。目前采用细胞周期标志物估算现场生产率的研究中面临的主要问题有以下几个方面：

(1)目前的研究主要是针对费氏杀鱼藻Dunaliella tertiolecta的，缺乏对其它浮游植物，特别是海域优势藻和多发赤潮藻的研究，研究多处于对实验室培养的纯种藻的测定，缺乏更多的现场实验。

(2)通常作为管家基因的基因在不同种类间具有高度的同源性，在对现场样品测定时会产生非特异性扩增，影响结果的准确性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种中肋骨条藻细胞色素b基因的RFQ-PCR检测方法，本发明检测方法，可以用于中肋骨条藻的定量、或作为中肋骨条藻检测中的管家基因研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测等领域，克服现有技术中单一品种浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数无法测定的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种中肋骨条藻细胞色素b基因的RFQ-PCR检测方法，包括以下步骤：

a.提取中肋骨条藻RNA；

b.分离并克隆中肋骨条藻细胞色素b基因，得到700～740bp的中肋骨条藻细胞色素b基因序列，并从GenBank上获取分类地位与中肋骨条藻相近的多个藻种的细胞色素b序列，构建系统树；

c.将获得的中肋骨条藻细胞色素b基因序列为靶区域，设计适用于RFQ-PCR方法的引物与探针，进行RFQ-PCR；

d.根据获得的700～740bp的中肋骨条藻细胞色素b基因导入质粒并转载到大肠杆菌中，经大量培养，提取所述质粒作为标准品，序列构建标准曲线，通过标准曲线检测待测中肋骨条藻细胞色素b基因。