[发明专利]从哺乳动物凝固血中提取基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因组DNA的提取方法，特别是涉及一种从哺乳动物凝固血中提取基因组DNA的方法。

背景技术

基因组DNA的提取是哺乳功能基因组学研究中困扰人们的一个难题。一般而言，DNA可以从各种样品材料中获得，包括抗凝血，凝固血，裂解血，软层细胞，毛囊，奶，精液等，如考虑下游试验，抗凝血是获得高质量DNA的最好材料，也是提取DNA最易处理的材料。而且考虑到动物福利和收集大量样本的原因，凝固血是最容易获得的材料。拿奶牛为例，每年所有的奶牛个体都要采取非抗凝血以获得血清进行例行的血清学和病毒检验检疫，在取得了血清后凝固的血块通常被丢弃。当需要检测大样本时，比如QTLs定位和关联分析，传统的蛋白酶K消化和酚/仿抽提法步骤繁琐且消耗时间长。目前，从哺乳动物凝固血中提取DNA的几种简单方法已有报道(Salazar L.A.，HirataM.H.，Cavalli S.A.，et al.Optimized Procedure for DNA Isolation from Fresh andCryopreserved Clotted Human Blood Useful in Clinical Molecular Testing.ClinicalChemistry，1998，44：1748-1750.Kanai N，Fujii T，Saito K，Yokoyama T.Rapid and SimpleMethod For Preparation of Genomic DNA from Easily Obtainable Clotted Blood.J ClinicalPathology，1994，47：1043-1044.Garg U.C.，Hanson N.Q.，Tsai M.Y，et al.Simple andRapid Method for Extraction of DNA from Fresh and Cryopreserved Clotted Human Blood.Clinical Chemistry 1996，42：647-648.Siafakas N.，Burnett L.，Bennetts B.and Proos A.Nonenzymatlc Extraction of DNA from Blood Collected into Serum Separator Tubes.Clinical Chemistry，1995，41：1045-1046)，但是这些方法需要用到对人体有害的有机溶剂，如酚和氯仿。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，经济和安全的从哺乳动物凝固血中提取基因组DNA的方法。

本发明提供的一种从哺乳动物凝固血中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)将剪碎的哺乳动物凝固血用双蒸水清洗去除血红素，再将其与裂解液按体积比为3-5∶5混合，向混合液中加入蛋白酶K至终浓度为360-400mg/mL混合液，然后将混合液在55-65℃下水浴3-6小时至溶液中不再有粘稠的团块；所述裂解液由NaCl、Na₂-EDTA和SDS组成，它们的浓度依次为140-160mM、40-60mM和1-2克/100毫升裂解液；

2)将步骤1)获得的混合液与5.5-6.5 M NaCl溶液和氯仿按体积比为1∶0.5-0.9∶1.5-1.9混合后，振荡，再离心，留上清；

3)将上清液与体积/体积百分浓度为90-100％的冰乙醇按体积比1∶0.8-1.2混匀，得到的白色沉淀为基因组DNA。

在上述从凝固血中提取基因组DNA的方法中，血凝块的大小会影响消化的效率，凝块越小越能缩短消化的时间，因此，步骤1)中最好将血凝块剪碎成比较小的微粒；此外，在剪切不同个体的凝血样本时，应将剪刀先后用浓度为70％(V/V)的乙醇和浓度为0.9％(W/V)的NaCl溶液洗涤至少3次，以避免交叉污染。所述剪碎的凝固血与裂解液的体积比优选为4∶5；加入蛋白酶K的终浓度为380mg/mL混合液。

步骤1)中裂解液的配方优选为：150mM NaCl，50mM Na₂-EDTA和2％SDS；蛋白酶K的终浓度优选为380mg/mL；水浴温度优选为55℃，此外，水浴期间(特别是前半个小时)还需振荡，以避免血凝块在离心管底部沉积。