[发明专利]一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法

权利要求书

1.一种利用细菌发酵生产番茄红素的方法，它包括如下步骤：

(1)菌种选择：选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus sub.rimosus)；

(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有1.5～2.0％琼脂的YM固体斜面基本培养基上，25～30℃培养2-3天；

(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50～150mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24-48小时，制得一级种子；

(4)扩大培养：按体积比5％的接种量，接一级种子于300～1000mL的液体发酵培养基中，25～30℃条件下，在摇床上振荡培养24～48小时，制得二级种子；

(5)发酵罐培养：按体积比8％的接种量，接二级种子于3-5L液体发酵培养基中，在25～30℃条件下，培养24～96小时，并进行分批补料，期间定时测定番茄红素含量，至单位体积番茄红素产量达到最高时，终止发酵培养；

(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液，在10,000转/分条件下离心15～20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤2～3次，湿菌体在4℃储存，备用；

(7)番茄红素的提取：选用氯仿萃取法、丙酮浸提法及酸水解法中的任意一种方法进行菌体内番茄红素的提取；

(8)样品检测：采用分光光度计法或高效液相色谱(HPLC)法对步骤(7)中所得的样品进行番茄红素含量测定，计算出产量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中涉及的YM固体基本培养基配方是：酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂15g/L，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)、(4)、(5)中涉及的发酵培养基可选自YM培养基、YM+金属离子培养基及淀粉培养基中的任一种，所述三种培养基的配方是：

YM培养基：酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；

YM+金属离子培养基：酵母粉3.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄.7H₂O，0.1g/L CaCl₂.2H₂O，调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；

淀粉培养基：玉米淀粉5.0g/L，黄豆饼粉50.0g/L，蛋白胨40.0g/L，硫酸铵3.0g/L，12.5g/L KH₂PO₄，1.0g/L MgSO₄.7H₂O，3.0g/L CaCO₃.2H₂O，2.5g/L NaCl，调节pH 7.0，121℃条件下灭菌20分钟。

4.根据权利要求1-3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的菌种选用龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus  sub.rimosus)ATCC 33024。

5.根据权利要求1-3之任一项权利要求所述的方法，其特征在于步骤(5)中所述的培养温度是28℃，培养时间是72小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(7)中所述的提取方法的具体步骤分别为：

氯仿萃取法：将菌体用蒸馏水重悬，浓度达到50～200克湿细胞/升，超声波破碎后，离心得粗番茄红素溶液，之后按1∶1比例加入三氯甲烷，45℃振荡萃取4小时，静置分层，取下层即为番茄红素溶液；

丙酮浸提法：可将菌体重悬于丙酮溶液中，超声波破碎，45℃振荡抽提3次，至菌体发白，离心取上清即为番茄红素粗提液；

酸水解法：可将菌体水洗2次，按1g菌体加入5ml 4mol/L HCl处理，25℃振荡1小时，然后沸水煮4分钟，迅速放入冰浴冷却，离心，弃上清，水洗2次，按1g菌体加入1∶1的石油醚∶丙酮溶液10ml处理，35℃振荡抽提1小时，8,000rpm离心10分钟，上清液即为番茄红素粗提液。