[发明专利]乳腺癌标志基因群及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及功能基因组学的疾病相关基因的表达谱研究和标志基因群筛选。具体讲是在人功能基因组范围内筛选乳腺癌的标志基因群，并用基因芯片，分子杂交和RT-PCR等方法检测这些基因的mRNA表达水平，根据mRNA表达水平鉴别乳腺肿瘤的良、恶性。

技术背景

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，是妇女健康的重大威胁，早期诊断是提高乳腺癌治愈率和生存率的关键。肿瘤是多基因异常的疾病，而且肿瘤组织细胞具有异质性生物学特征，在乳腺癌的发生过程中涉及包括癌基因的激活和抑癌基因的失活、细胞代谢和细胞周期调控的紊乱，细胞凋亡的抑制等复杂的生物学过程。目前已发现百余种肿瘤促进基因如K-ras，c-myc，c-erbB-2等和几十种肿瘤抑制基因如P53、Rb、P16等与癌发生相关，但单个基因检测或部分已知基因的联合检测尚不能对乳腺癌组织标本与正常组织标本进行诊断和鉴别诊断。基因芯片技术可以高通量平行检测数千到数万个基因的表达水平，从而可以从基因组范围内对组织细胞的基因表达谱进行研究，筛选得到恶性肿瘤区别于正常组织的标志基因群，用于肿瘤的诊断和鉴别诊断。

发明内容

本发明采用高通量的人表达谱基因芯片通过比较多病例的乳腺原发癌及其配对的癌旁正常乳腺组织基因表达差异，筛选得到一组乳腺癌的标志基因群，用基因芯片、分子杂交、RT-PCR等方法检测标志基因群中的一个、多个或全部基因的mRNA水平，进而对乳腺肿瘤作出鉴别诊断。主要发明如下：

1.一组乳腺癌标志基因群，其特征为该组基因群中的一个、多个或全部基因的组合可以用于鉴别乳腺良、恶性肿瘤，基因群中120个基因的名称、序列号及主要功能描述见表1。

2.权利要求1所述基因的多个或全部基因的组合制备成基因芯片用于良、恶性乳腺肿瘤的鉴定，其特征在于将这些基因的cDNA或寡核苷酸探针固定成微阵列，其中每个基因探针可以特异性地与来源于组织样本中相应基因的cDNA或其扩增产物杂交，按分类，微阵列可以是平板、微珠、细针或膜相阵列，可以是固相、液相；可以是寡核苷酸、多核苷酸或者cDNA阵列。

3.权利要求1所述基因的单个或多个基因作为核酸分子杂交的探针、或RT-PCR扩增的目的基因检测组织标本中的mRNA表达量，根据mRNA表达水平鉴定良、恶性肿瘤，核酸分子杂交可以是提取的RNA及其反转录的cDNA在固相支持物上的杂交、也可以是组织切片的原位杂交，RT-PCR可以是定量方法、半定量方法、定性方法。

4.利用权利要求2所述的基因芯片鉴别乳腺癌与正常组织或良性肿瘤的方法：

(1)乳腺肿瘤组织或正常组织样本的cDNA或其扩增产物荧光标记后与包含乳腺癌标志基因群的多个或全部基因的基因芯片杂交，基于各基因的荧光强度值，利用非监督聚类分析方法即得到能将乳腺癌组织和正常组织准确分类的基因表达谱；

(2)使用基因表达图谱对乳腺肿瘤进行鉴别诊断，包括以下步骤：包括以下步骤：

a)从乳腺肿瘤患者的手术切除样本或针吸活检样本中提取总RNA并反转录为cDNA；

b)对样本的cDNA或其扩增产物进行荧光标记；

c)用标记后的样本与权利要求2中所述的基因芯片杂交

d)用非监督聚类分析样本基因表达谱，与权利要求4中所述的基因图谱比较对患者组织标本的良、恶性作出鉴定。

附图说明

图1是基于差异基因群对9例乳腺原发癌和配对正常乳腺组织的聚类；

图2是基于差异基因群对验证样本与训练样本的聚类结果。

具体实施方式

1技术措施

1.1病例选择和标本处理

24例乳腺癌患者为天津医科大学附属肿瘤医院收治的行乳腺癌根治术的病例，病理类型均为浸润性导管癌(WHO分类)，肿瘤大小均为2～5厘米(T2期)；组织学分级I级1例，II级19例，III级4例；淋巴结转移阳性15例，阴性10例；ER阳性17例，阴性6例；PR阳性11例，阴性12例。癌组织样本经组织病理学诊断证实，癌旁正常乳腺组织取距离肿瘤边缘5cm以上的正常腺体组织，标本取材后经液氮速冻于-80℃保存。另外，取32例乳腺肿瘤患者的正常乳腺组织，提取总RNA后等量混合作为基因芯片杂交的对照样本。

1.2基因芯片杂交