[发明专利]Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测Asial型口蹄疫病毒抗原的快速诊断试纸条，以及其制备方法。

背景技术

口蹄疫作为重大动物疫病，世界各国对该病的检验检疫、预防控制都十分重视。目前检测、诊断口蹄疫的主要方法是检测发病或带毒动物体内的口蹄疫病毒及其抗体水平，如分离病毒、ELISA测定抗体等方法。分离病毒是对口蹄疫的最可靠的诊断，但较长的周期会延误对该烈性传染病的最佳控制时间；ELISA测定抗体虽然简单易行、但需要区分是自然感染还是由于疫苗免疫产生的抗体，不能及时做出诊断；此外，以上的实验方法还需要昂贵的仪器设备、专业技术人员等诸多条件。因此，研制直接检测口蹄疫病毒抗原的快速、便捷、适合现场使用的检测试剂盒不仅有很强的实用价值和广阔的应用前景，而且对我国口蹄疫的防控具有重要意义。

我国曾于2005年突发大面积的Asial型口蹄疫，疫情波及十几个省市，给我国的畜牧业生产造成重大经济损失。此次暴发不仅持续时间长，而且疫情复杂。此次暴发警示我们要及早开发研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂以及研制快速诊断试剂盒。因此，研制一种快速检测Asial型口蹄疫病毒抗原的测试物质是十分必要的。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种特异性高的检测Asial型口蹄疫病毒抗原金标快速诊断试纸条，和这种试纸条的制备方法。

本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条由固定于不透水材料上的用多孔纤维构成的加样段、位于加样段端部的由硝酸纤维膜构成的检测段和位于检测段端部的用多孔纤维构成的吸收段，其中：加样段上载有Asial型口蹄疫病毒单抗和胶体金的结合物，其检测线由另一株Asial型口蹄疫病毒单抗构成，其对照线由兔抗鼠抗体构成。

本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条中，不透水材料为PVC，所用的多孔纤维为无纺布。

本发明的检测Asial型口蹄疫病毒快速诊断试纸条的制备方法是：

首先制备Asial型口蹄疫病毒的单抗。

单抗制备过程：以Asial型口蹄疫病毒(该病毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1。将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株。将前述菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3～4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5～10∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，再静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，大量生产单克隆抗体。