[发明专利]粒－巨细胞集落刺激因子基因修饰的异基因肿瘤细胞疫苗

说明书

发明领域

本发明涉及粒-巨细胞集落刺激因子(以下称：GM-CSF)基因修饰的异基 因肿瘤细胞系及其在制备肿瘤疫苗中的用途。

发明背景

近年来，随着免疫学、分子生物学等技术的不断发展，我们欣喜地注意到 肿瘤疫苗已经走到了肿瘤治疗的前沿，并给广大患者带来了希望。应用自身的 灭活的肿瘤细胞作为抗原来治疗肿瘤已有上百年历史，但一直疗效不佳。近几 年来将自身的灭活的肿瘤细胞联合细胞因子进行治疗取得较大进展，大致的方 法是将患者自体肿瘤细胞通过基因载体转移细胞因子，成为可分泌细胞因子的 肿瘤细胞，再将其经致死剂量的放射线照射后皮内或皮下注射，成为肿瘤疫苗。 由于这些疫苗，通过基因转染使肿瘤细胞能够表达某些细胞因子或共刺激分子， 使得肿瘤细胞的免疫原性获得了大幅度的提高。其中又以转染GM-CSF基因效 果更好，通过GM-CSF转染到肿瘤细胞，使其表达GM-CSF蛋白，在注射局部 形成GM-CSF高浓度区域，从而使注射局部的抗原提呈细胞的功能大幅度增强。

鉴于目前大多数人类肿瘤细胞抗原类型仍未得到明确的鉴定，用全肿瘤细 胞作为疫苗的有效组分仍不失简单有效。自身肿瘤细胞作为疫苗已用于临床试 验，但在大规模的临床使用中，存在着几个问题：自体肿瘤疫苗需要利用患者 的肿瘤组织制备，病例选择和治疗次数受到取材的限制，而且花费较高；原代 肿瘤细胞在体外培养及基因转染等操作方面，存在较大困难；不同患者来源的 肿瘤细胞在遗传性状、基因转染效率等方面存在较大差异，难以质控等等，这 些因素限制了其广泛使用。

应用已建株的肿瘤细胞系具有独特的优势：①能够以较小的成本，克服自 体/异体肿瘤细胞取材难的问题；②其体外培养及基因转染等方面的技术趋于成 熟，可以提供表达稳定的抗原；③经治疗基因转染的肿瘤细胞系，其治疗因子 分泌量稳定，易于质控，因此更适合于开发及广泛应用。

到目前为止，有关应用GM-CSF基因转染异基因肿瘤细胞系制备瘤苗及其 机制研究及肿瘤疫苗与放化疗结合治疗肺癌的报道在国内外尚未见报道，本发 明人进行了这方面的研究，证明其在肿瘤主动免疫方面的有效性。

发明内容

本发明一方面提供了一种GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。

本发明GM-CSF基因修饰的异基因肿瘤细胞系。其中所述肿瘤细胞系为肺 癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞 系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3；其中GM-CSF是通过真核表达载体 pIRES-EGFP转染到所述肿瘤细胞系中的；其中GM-CSF是通过病毒载体转染到 所述肿瘤细胞系中的；其中病毒载体为腺病毒或逆转录病毒。

疫苗组合物，其含有上述任一项的转基因肿瘤细胞系和任选的可药用载 体。

上述疫苗组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。

可用的肿瘤细胞系可以选自肺癌细胞系LA795或A549、乳腺癌细胞系 MCF-7、胃癌细胞系803、结肠癌细胞系HCT-8或卵巢癌细胞系SKOV3等等。

本发明主要是利用GM-CSF基因修饰的同种异体肿瘤疫苗(即肿瘤细胞系) 作为治疗手段，因此比较有意义的是来源于人的肿瘤细胞系。

GM-CSF基因表达载体转染人肿瘤细胞系，同样可以整合到基因组DNA并 稳定表达该细胞因子(如后面提供的GM-CSF基因克隆、转染及筛选的实验方 法)。

在该种疫苗的治疗效果评价方面，由于应用于临床治疗的时间较短，仅能 就免疫反应进行监测(如DTH、注射部位的反应等)，而疗效观察还在进行中。 因此，试验周期短的动物实验就提供了评价异体疫苗效果的一种方法，我们构 建了GM-CSF基因修饰的小鼠肺癌细胞系LA795疫苗，而同时以另外一种小鼠 肺癌细胞系LLC接种小鼠构建动物模型，从而模拟人的异体疫苗的情况，来评 价该疫苗的治疗效果。

实验中利用动物实验探讨的主要问题--是否可以应用同种异体肿瘤疫苗作 为治疗，所以采用一种小鼠细胞系LLC接种后，用LA795制备疫苗，检验其诱 导免疫反应以及抑制肿瘤生长的作用，因此动物实验的意义并不是检验LA795 疫苗的作用，而是探讨异体疫苗是否可以应用以及治疗的效果。