[发明专利]西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法

说明书

一、技术领域

本发明属生物科学中的组织培养技术领域，具体涉及一种百合试管苗鳞片高效再生试管微型鳞茎技术。

二、背景技术

百合是世界五大鲜切花之一，不仅花姿优美，色彩丰富，气味芬芳，而且其鳞茎还具有食用和药用价值。因此，近年来对百合的研究日趋深入和广泛，特别是在组织培养及快速繁殖方面已走向了成熟化和工业化。西伯利亚百合(Siberia)属于东方百合杂种系，是近年国内外花卉市场热销的百合品种之一。

传统的百合繁殖方法主要采用常规分球、分珠芽、鳞片扦插、鳞片包埋等。采用这些方法进行繁殖，繁殖系数较小，特别是经多代繁殖以后，常造成种性退化，甚至病毒积累，影响百合的产量和品质。

组织培养技术能够迅速去除病毒和更新品种，加快繁殖速度、缩短育种周期。百合的组织培养使用最多的外植体是鳞片。百合鳞片作为外植体具有容易获得，分化能力强，对培养基要求不高等优点，是目前百合组织培养中普遍采用的外植体。自1982年陈为民、黄济明分别采用百合鳞片作为外植体成功诱导产生了百合的再生植株以来，国内外关于百合鳞片组织培养的报道较多，主要是通过调节激素的配比来诱导其组织分化并再生植株，但未见研究鳞片纵切片不定芽状微型鳞茎分化的报道。

三、发明内容

本发明的目的是寻找更好的百合组织培养新材料和有针对性的组织培养新方法，使西伯利亚百合试管苗鳞片高效再生不定芽状微型鳞茎，为该品种的组培快繁及产业化、转基因研究等提供技术基础。

研究发现，百合鳞茎不同部位的鳞片，分化不定芽的能力有差异，从强到弱依次为：外层>中层>内层。鳞片不同部位切段的不定芽分化速率和数量也存在差异，依次为：鳞片基部>中部>上部。

本发明的技术解决方案为：一种西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法，其特征是该方法包括以下步骤：

a.将西伯利亚百合试管苗置于养鳞茎培养基上培养约1.5个月，培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；

b.选取1～1.5cm直径的试管鳞茎，剥取外侧1～3层鳞片，在无菌条件下用锋利的刀具将鳞片纵向切为厚度1～2mm的薄片，接种于诱导培养基上诱导不定芽(微型鳞茎)的发生；培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；培养15天后可见不定芽状小鳞茎的发生；

c.不定芽状微型鳞茎2～3cm高时，转接入养鳞茎培养基培养，培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；

d.鳞茎直径达到1.5～2.0cm时，移入2～4℃的冷库中培养30～50天；

e.打开瓶口在大棚中常温炼苗3～5天，自来水洗净根系上的培养基，移栽入珍珠岩和草炭土比例为1∶3的移栽基质中自然生长育苗。

18天后可见地上茎抽出地面。植株生长健壮，且整齐一致。

上述方法中：养鳞茎(俗称养球，指在组织培养条件下，使微型鳞茎和小鳞茎直径迅速增大的培养过程。其中，直径0.5cm以下定义为微型鳞茎，0.5以上定义为小鳞茎)培养基配方为：MS培养基添加蔗糖80～100g/L。

附MS培养基(Murashing and Skoog medium)标准配方：

NH₄NO₃            1650mg/l

KNO₃                  1900mg/l

CaCl₂·2H₂O       440mg/l

MgSO₄·7H₂O       370mg/l

KH₂PO₄            170mg/l

KI                        0.83 mg/l

H₃BO₃             6.2mg/l

MnSO₄·H₂O        16.9mg/l

ZnSO₄·7H₂O       8.6mg/l

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/l

CuSO₄·5H₂O       0.025mg/l