[发明专利]固体－液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法

说明书

一、技术领域

本发明属林业中的通过组织培养的植物再生技术领域，具体涉及一种固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生技术。

二、背景技术

鹅掌楸，又称马褂木、鸭脚木、九层皮、枫荷树等，是木兰科(MagnoLiaceae)鹅掌楸属(Liriondendron)的植物。该属现在仅存两种，一种是分布于我国中、北亚热带地区(从东部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越边界)的中国鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.] Sarg.)，另一种是分布于美国东部的北美鹅掌楸(L.tulipifera L.)。鹅掌楸属植物在被子植物分类地位中处于较原始的位置。虽然分布区广，但目前多呈小群体分布。其中分布于中国境内的鹅掌楸已被列为国家二级珍稀濒危保护树种。

中国鹅掌楸干形通直、树形美观；叶形奇特，叶片宽大，微凹，两侧有一裂片，先端截形，叶形俨然如中国古装马褂一般，故俗称马褂木；春天枝条顶端开淡黄色大型花朵，其状如杯似碗，光灿悦目，观赏价值高；果实圆锥形，亦极美观。该树种对二氧化硫和氯气有较强的抗性，广泛用于园林绿化。另外，鹅掌楸属植物木材淡红褐色，纹理通直，色泽美观，结构细密，材质轻软，刨面光洁，适合于用作胶合板、纸浆、家具以及室内装饰用材，也可用于建筑、造船等，经济价值极高，因此也是重要的用材树种。

作为世界珍稀名贵观赏风景树的北美鹅掌楸，同样树姿挺秀，叶形美丽，树形端正，树序整齐，花大而美。老龄树枝条平展，或微向下垂。每届花期，琼英压树，翠帷覆地，绮丽优雅。

叶培忠[1899～1978]教授于1963年首次选用中国鹅掌楸和北美鹅掌楸为亲本进行正、反交组合人工杂交，育成种间杂种杂交鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipifera L.和L.tulipiferaL.×L.chinense[Hemsl.]Sarg)；1970年开始进行杂交鹅掌楸正、反交组合苗木栽培对比。试验表明，种间杂交后代具有明显的杂交优势，不仅树形比亲本更加通直，花叶更加幽丽，媲美众芳，俯视众卉，而且生长也更加迅速。如栽植于浙江富阳中国林科院亚林所的杂交鹅掌楸，25年生时树高达21m，胸径达63.7cm；另据北京市园林局将杂交鹅掌楸作城市行道树试种，在北京地区表现出耐寒性强，生长迅速的特点；同时该树种无其他树种果毛、花絮飞散造成的空气污染之弊。因此，林业上对优质杂交鹅掌楸苗木的需求相当迫切。

但鹅掌楸的天然结实率很低，亲本和杂交新种均仅有1％左右，有性繁殖能力差；鹅掌楸的扦插技术要求很高，扦插周期长、成活率低，无性繁殖困难。因此，目前的种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林的需要。

体细胞胚胎发生及其植株再生技术是20世纪90年代形成的高新林业生物技术的重要内容之一，可用于优良品种的大规模工业化繁殖和用于遗传转化体系的建立。体细胞胚，是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的过程，模拟合子胚发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生和重建过程。在正常情况下有些植物的珠心组织或助细胞也可自发产生体细胞胚。在大量的组织培养过程中，许多离体培养的细胞、组织和器官，形成类似胚的结构。这种经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。无性胚状体可以像有性胚那样在一定的条件下发育成完整的植株。胚状体按其来源可分为两类：一类是由普通植物孢子体的各种器官的二倍体体细胞产生而来，通常称为体细胞胚；另一类是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常简称为花粉胚，可发育成单倍体植株，但一般必须进行染色体加倍才能正常开花结实。另外，在一些植物中也可从胚乳培养得到胚状体，但未能成功地由胚状体发育成植株。朱微认为胚状体的定义包括三点含义：

1.胚状体是组织培养的产物，只限于在组织培养范围内使用，区别于无融合生殖的胚；

2.胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；

3.胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于与组织培养中分化的芽体。