[发明专利]一种修饰的重组人内皮抑素及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制品制药技术领域，涉及一种修饰的重组人内皮抑素及其应用。

背景技术

1971年，Folkman教授提出“肿瘤的生长依赖于新生血管生成”这一观点，通过阻断新生血管生成，就有可能控制肿瘤生长，达到遏制肿瘤侵袭、复发、转移的目的，从此开创了肿瘤治疗的新领域。

1997年，哈佛大学O’Reilly等发现小鼠血管内皮瘤细胞的培养基具有内皮细胞抑制作用，通过纯化发现该活性物质在一定浓度范围内(100ng/ml～600ng/ml)特异性对内皮细胞表现出剂量依从的生长抑制作用。通过N端氨基酸测序表明该物质为胶原XVIII的C末端片段，分子量20kD左右，这个蛋白就被命名为内皮抑素(Endostatin，ES)。

研究表明内皮抑素能够有效控制非小细胞性肺癌、结肠癌、脑胶质瘤、纤维瘤、间皮瘤及淋巴瘤等各种实体瘤的生长、浸润和转移。目前，内皮抑素的获得都是通过基因工程的方法。由于真菌表达内皮抑素成本太高，人们更倾向于利用大肠杆菌作为表达体系，但这样表达出的蛋白存在复性率低等问题。为此，人们开始尝试对天然内皮抑素进行结构改造。其中罗永章等在天然Endostatin的N末端添加了9个氨基酸，不仅使ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名为恩度(Endostar)。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：

(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGL

AGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIF

SFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLL

GQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。

III期临床实验表明改造后的内皮抑素与化疗药物NP联用可能有一定的协同作用，可延长患者的肿瘤进展时间。

临床实验证实内皮抑素毒副作用很小，适合与放疗或化疗联用。但是内皮抑素作为小分子蛋白，性质不稳定，有研究表明，内皮抑素在缺氧条件下容易降解，当内皮抑素与内皮细胞在低氧环境下共孵育48小时后，含量会下降20％左右。而肿瘤内部恰是低氧环境，对于其活性的发挥很不利。另一方面，目前Endostar临床用药量很大，为7.5mg/m2，需要每天静脉滴注3～4小时完成给药。实验表明，给药方式为腹腔注射时，内皮抑素在2小时内清除。这些现象表明，内皮抑素在进入体内后，尤其是在发挥药效的肿瘤局部可能会被蛋白水解酶水解。如何对蛋白分子进行保护，防止酶解，降低清除率从而减少给药剂量是急待解决的问题。

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一种安全的、无活性、无毒的聚合物。通过共价连接至蛋白质上进行化学修饰，聚乙二醇化(pegylation)在保留天然蛋白质的内在生物学活性的同时，能有效地克服蛋白质类药物在临床应用中的一些缺点，如可以提高血浆半衰期，增强生物利用度，减低蛋白质免疫原性、提高药物疗效及安全性等。目前为止，成功上市的PEG修饰蛋白多肽药物有酰苷脱胺酶()、天冬酰胺酶()、干扰素α-2b()、干扰素α-2a()等，而更有尿酸酶、水蛭素、白介素-2、白介素-6等20多种药物正进行临床研究。

在蛋白质PEG化过程中，活化的PEG分子偶联到蛋白分子中的自由氨基上，主要是Lys上。由于蛋白质链中自由氨基不只一个，反应产物中不仅存在单分子、双分子甚至三分子等多类修饰产物，而且各类修饰产物中还包括多种异构体。与单分子修饰产物相比，多分子修饰产物活性损失大，不仅浪费了反应底物，而且降低了反应产物的总体活性。通过控制反应条件和采用纯化手段可以克服多分子修饰产物的问题，而获得单分子修饰产物。但是单分子修饰还存在异构体的问题，异构体在生物活性上可能存在较大差异且异构体的混合物通常很难进行纯化。所以最好的是能通过控制反应条件，实现定点修饰，以帮助产物的纯化和性质研究。而且定点修饰对蛋白活性的保持更为有利。Kinstler利用N末端的α氨基比赖氨酸的氨基有更低的pKa值发明了一种方法。用PEG乙醛修饰粒细胞集落刺激因子(G-CSF)得到了

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