[发明专利]一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，属于生物技术领域，专用于用于不结球白菜游离小孢子再生植株倍性的快速鉴定。

二、技术背景

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，原产中国，是我国南方普遍种植的最大众化蔬菜，在蔬菜的周年供应中起着举足轻重的作用。不结球白菜为典型的异花授粉作物，自交衰退严重，优良杂交组合优势明显。利用单倍体途径的小孢子培养技术，可加速育种材料纯化，缩短育种周期，加速育种进程。通过游离小孢子培养获得的再生植株群体，除育种家需要的双单倉体(DH)植株外，还包含单倍体、三倍体、四倍体及非整倍体等，育种家必须花费大量的时间来鉴别真正的单倍体植株。有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用小孢子再生植株的基础，特别是苗期倍性鉴定不仅可以大大减少育种工作量，而且可以提前进行分子标记辅助选择和遗传图谱构建工作。

不结球白菜从苗期到开花期，没有明显的形态学性状可用于区别不同的倍性水平。尽管在开花期单倍体可能产生不正常的花和败育的花粉，个别四倍体植株可能产生较大的花，但二倍体和四倍体仍然难以区别。因此，长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性，主要方法有：花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等(刘仁样，1998；王培，1989)。这些显微方法不仅费时，而且技术难度大。此外，采用花粉大小判别法需在开花期进行，占地且费时；而采用保卫细胞长度测量法，由于单倍体和二倍体以及二倍体和四倍体的保卫细胞长度重叠而不准确。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法，流式细胞仪集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。目前，流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，但在植物方面的应用直到20世纪80年代中期才开始。由于流式细胞仪可以直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平，不受植株生长发育时期和环境条件的影响，省时、高效，还可以检测出非整倍体以及混倍体。并已被成功地用于花椰菜(CHIANG，1985；ROULUND，1990)、青花菜(WANG，1999)、抱子甘蓝(周元昌，2002)、大白菜(韩阳，2006)的花培苗倍性鉴别上，但至今还未见该方法用于不结球白菜小孢子再生植株倍性鉴定的报道。应用流式细胞仪进行不结球白菜游离小孢子培养再生植株倍性分析将提高鉴定效率，从而加快育种进程。

三、发明内容

技术问题：本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，针对上述现有技术中不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定存在的问题，将流式细胞仪应用到不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定上，建立不结球白菜游离小孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系，从而提高不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定效率，加速育种材料的选育和遗传图谱的构建。

技术方案：对试管苗进行流式细胞仪倍性分析。由于DNA含量与荧光信号强度呈正比，以普通二倍体不结球白菜‘暑绿’(2n＝20)为对照，峰值与对照相近的为二倍体，为对照1/2的为单倍体，从而确定出样品的倍性水平。出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体，混倍体又可根据各峰值与二倍体峰值的倍数关系确定其构成细胞的倍性组成。

一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，包括：

(1)单细胞悬浮液的制备：