[发明专利]一种酵母三杂交检测方法及其在藻毒素检测中的应用

说明书

一、技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及小分子化合物的酵母三杂交检测系统，以及该检测方法在藻毒素检测的应用。

二、背景技术：

酵母双杂交系统是Fields和Song于1989首先描述的在细胞内分析蛋白与蛋白相互作用的一种新颖的系统，近年来，这种研究蛋白质间相互作用的实验方法已得到愈来愈广泛的应用。它是一种直接在细胞内检测蛋白质相互作用的分子遗传学方法，灵敏度很高，比以往的各种生化手段具有更为明显的优势。利用这一系统已经证实和筛选了许多具有相互作用的蛋白质，并逐渐推广到了细胞凋亡、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。

酵母双杂交系统有以下几个特点：(1)在真核细胞内检测蛋白质间的相互作用，具有真实的蛋白质作用环境；(2)在基因水平上操作，无需提纯待研究蛋白质，也无需相应的抗体；(3)可检测蛋白质间较微弱的相互作用及短暂作用；(4)可进行文库筛选，从而获得与已知蛋白作用的未知蛋白的基因；(5)可用于寻找蛋白质相互作用的结构域；(6)可检测基因突变对其编蛋白质功能的影响。

微囊藻毒素是由淡水微囊藻产生的次生代谢物，结构为环状七肽，分子量约1000Da，一般组成为：环(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸)，其中Adda为一种特殊氨基酸，结构为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6二烯酸。藻毒素对生物机体具有多种毒理作用，是一类较强的肿瘤促进剂，可诱发大面积肝损伤甚至肝肿瘤，并产生多脏器损害，国外资料已连续报导了多起因MCs污染而导致的人群、家畜、鱼类患病甚至死亡的事件，国内流行病学调查也发现MCs是导致某些地区人群原发性肝癌比率居高不下的主要原因之一。2007年春季在无锡地区太湖大规模发生的蓝藻暴发使得微囊藻毒素的快速、简便的检测成为当务之急。

目前检测MCs的方法主要可归纳为三种，即生物学、生物化学和分析化学检测法。生物学测试法主要采用毒理学检测的方法，用动物急性毒性试验来间接推算MCs的毒性；生物化学检测法主要有酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunoadsorbent assay，ELISA)和蛋白磷酸酶抑制法(Protein phosphoataseinhibition assay，PPIA)；化学检测技术主要包括HPLC、TLC、气相层析(GC)、液质联用分析(LC/MS)、毛细管电泳(CE)、胶态电动学色谱(MEKC)、反相液相色谱-电离子化质谱联用技术(RPHPLC/EIMS)等方法。生物学方法和生物化学方法虽然可以检测MCs，但是不能做到准确定量、而且价格较高或费时较长，例如：商业化的ELISA检测试剂盒价格较高，不能在环境监测中得到普及使用；化学方法的特点是精确客观，但大多必须配备大型精密分析仪器，因此不能用于样品的实时、原位分析。

我们在前期研究中应用噬菌体表面展示肽库技术从随机12和7肽库中筛选获得若干与藻毒素有相互作用的多肽，成功获得了能与MC-LR相互识别的噬菌体克隆，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)和免疫沉淀(IP)的检测，证明这些小肽片段对藻毒素有特异性的结合(Zhao SW，Shen PP，Zhou Y，Wei Y，Xin XB，Hua ZC，Environment International 31(4)：535-41，2005)。我们从12肽库筛选获得9个小肽，这9个多肽都具有-WHWX0-2W-的保守序列，这些小肽经ELISA分析与藻毒素具有较高的亲和力。从7肽库筛选获得8个短肽，这些短肽经ELISA分析与藻毒素具有较高的亲和力，这些短肽有的具有-QP-保守序列、有的没有任何保守序列。

三、发明内容：

为克服已有技术的缺点，本发明有如下二个目的：1。将酵母双杂交系统只能用于细胞内分析蛋白与蛋白相互作用，创新和改进成为能够检测短肽和小分子化合物相互作用的酵母三杂交检测体系；2。提供一种简便易行、成本低廉的藻毒素酵母检测系统，用于藻毒素的检测。