[发明专利]化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种化学合成的单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1，HSV1)糖蛋白B(glycoproteinB，gB糖蛋白)胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gB糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒的gB糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV1病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)是危害人类健康的常见病原体，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-1及HSV-2两型。1型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近年HSV1的感染显著增多，约占该病的10％～40％。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性，所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及Glaxo SmithKline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-O-酰化单磷酸类脂A和明矾)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。

HSV包膜糖蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激机体产生免疫应答及疫苗研制中具有重要地位。目前正式命名的HSV包膜糖蛋白有12种，其中gB糖蛋白在感染的细胞中含量最多，是疱疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株间差异较小，且与所有的疱疹类病毒亚群有较大的同源性，同时gB蛋白具有较强的免疫原性，可诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应，因此HSV1gB糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。

HSV1gB糖蛋白基因全长2712bp，编码29个氨基酸序列的信号肽、696氨基酸序列的胞外区、69氨基酸序列的跨膜区、109氨基酸序列的胞内区。去除部分信号肽序列不影响其在原核细胞中的分泌表达。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gB基因构建的疫苗，与用完整gB基因构建的疫苗对HSV-1病毒攻击具有相同的保护作用。目前应用的HSV1病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，其使用的抗原是全病毒抗原，具有生产较危险、成本高、与其它病毒有交叉反应等缺点。目前缺乏HSV1病毒疫苗。灭活疫苗的研究取得了较大进展，但是生产成本高、危险大。

发明内容

本发明目的是针对上述不足之处提供一种化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸-第696个氨基酸，共696个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV1病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV1病毒单抗和多抗等。

化学合成的HSV1病毒gB糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下方案实现的：

1.HSV1病毒gB糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：

利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV1病毒gB糖蛋白的氨基酸序列，筛选出gB糖蛋白的N端(第1氨基酸-第696氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了BamHI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，在3’端增加了终止密码子(TGA)和EcoRI酶切位点(下画线部分)及两个保护碱基(GC)，使该基因片段易于克隆至质粒pGEX4T-2内的BamHI和EcoRI酶切位点内。

筛选的HSV1病毒gB糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第1个aa-第696个aa)：

Pro Ser Ser Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly