[发明专利]猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失菌株

说明书

一、技术领域

本发明涉及猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS₂)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失菌株的构建和特性研究，属于生物技术领域。

二、背景技术

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人畜共患病原菌。可引起青年猪患脑膜脑炎、肺炎、关节炎、败血症及新生仔猪突然死亡，对人主要引起脑膜炎和败血症，严重危及人畜的身体健康。1998年江苏南通和2005年四川资阳引起人猪死亡的病原即为SS₂。

在SS₂中，已发现的毒力因子主要包括溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、new orf2、纤粘蛋白(Fn)、荚膜多糖(CPS)、纤维蛋白原结合蛋白(FBP)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、分泌型核酸(SSnA)和三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。这些毒力因子并不能完全解释SS2的致病机理，从病猪体内分离获得的具有不同基因表型的菌株以及人为构建的各种毒力因子的缺失株也进一步证实这一点。次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)是我们前期工作中发现，较为详尽的研究表明其可以明显改变Hep2细胞膜的通透性，利于菌体穿过细胞膜屏蔽进入细胞内增殖，进而致病。IMPDH是鸟嘌呤核苷酸GTP经典合成途径的限速酶，可以明显改变Hep2细胞周期，导致G1期和S期延长，调控链球菌在宿主机体内的增殖速度和数量。构建IMPDH缺失株，进而研究其对生长特性和致病性的影响。所以对SS₂的毒力因子及致病机制的研究是一项很必要的工作，是防制SS₂的重点。

三、发现内容

技术问题本发明目的在于构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS₂)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失株，研究其致病性，进而为研制SS₂的基因缺失灭活疫苗奠定基础，为更加安全而有效的防控猪链球菌病提供技术支持。

技术方案本发明的具体实施方案如下：

猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS₂)次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)缺失菌株，其特征在于，所说的细菌缺失IMPDH基因中第3～943个碱基。

构建上述缺失菌株的方法，包括：

(1)获取IMPDH的IN和IC及cat基因，并串联克隆入simple pMD18-T载体

根据GenBank登陆的IMPDH序列，序列号为DQ097893，设计两对特异性引物，以SS₂-H菌株制备的DNA为模板，分别扩增IMPDH基因5’端上游和3’端下游654bp和574bp序列，其中IMPDH-NR包括IMPDH基因5’端起始3个碱基，IMPDH-CF包括IMPDH3’端末尾14个碱基：

IMPDH-NF：5-taagtcgacaagacagccttgctagcagg-3

IMPDH-NR：5-gccggatcccatgttctttcctttct-3

IMPDH-CF：5-agaggatccgtctatttgcataaaggag-3

IMPDH-CR：5-gaagaattcaattcacgcggactacacatca-3

IMPDH-NF和IMPDH-CR引物两端分别加限制性酶切位点Sal I和EcoR I及保护性碱基，IMPDH-NR和IMPDH-CF引物两端加同样的限制性酶切位点BamH I及保护性碱基，下划线部分均为酶切位点，PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃ 1min，56.5℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；

根据GenBank登陆的pSET₃序列，序列号为AB042431，设计一对特异性引物cat-F和cat-R，以pSET₃质粒为模板扩增整个的Cm表达盒：

cat-F：5-tcaggatcctaattcgatgggttccgagg-3

cat-R：5-tctggatcccaccgaactagagcttgatg-3