[发明专利]一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

喹诺酮是一类合成抗生素类药物，英文名称：quinolones(QNS)。在化学上与萘啶酮酸相关，其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到治疗系统感染疾病，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来，这些药物在动物组织中的残留已引起广泛的注意，我国规定牛、鸡、猪、羊、兔等动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01～1.9mg/kg，欧盟规定在动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01～1.9mg/kg，日本在2002年7月1日对我国产蒲烧鳗鱼实施磺胺类抗生素检测后，又于2003年7月1日起对进口生鳗鱼及其制品进行氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留检测，并且将限量控制在方法检测限的0.05mg/kg。因此，氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。为了建立快速检测方法有必要合成一种喹诺酮抗生素多簇抗原，到目前为止，喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法还未见国内报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法，所合成抗原所制备的抗体可对多种喹诺酮类抗生素产生识别，为今后人们的快速检测的研究提供了方便的途径。

本发明的技术方案：一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法，以诺氟沙星为原料将其衍生化制备半抗原，进而再与牛血清蛋白采用戊二醛法偶联合成抗原；

工艺步骤为：

(1)人工半抗原的合成

合成路线：

产物1的合成：

2-溴乙胺氢溴酸盐和碳酸二叔丁酯Boc₂O反应，配比控制为碳酸二叔丁酯摩尔比过量20％，以甲醇为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到60℃，反应1h，然后室温反应过夜；反应液真空浓缩，残液溶于二氯甲烷，依次用0.5N的盐酸、饱和食盐水和饱和的NaHCO₃溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得淡黄色液体产物1，直接用于下一步反应；

产物2的合成：

产物1和诺氟沙星反应，配比控制为产物1摩尔比过量20％，以二甲基甲酰胺为反应介质，三乙胺为催化剂，搅拌、加热升温到80℃，反应过夜，冷至室温，滴加0.5N的盐酸控制pH至6，搅拌使体系重新冷却到室温，过滤，依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼，干燥，得粗产品产物2，用乙醇重结晶；

产物3的合成：

产物2和三氟乙酸反应，脱碳酸二叔丁酯基：室温搅拌反应3小时，真空浓缩，将残留物溶于乙醇，加入三乙胺，静止，过滤得到的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯，得产品3半抗原，命名为N-2-乙胺-诺氟沙星；

(2)人工抗原的合成：合成路线：

透析袋的前处理：取5-10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

磷酸盐缓冲溶液的配置：0.2Mol/L磷酸二氢钠19mL，0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为ph7.4的磷酸盐缓冲液。

偶联蛋白：

取0.1mmoL的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液，滴加至使戊二醛的最终质量浓度为1.25％，成A液；

取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液；

搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中，搅拌过夜，PBS透析5天，得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白；

(3)抗原鉴定：2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，分别在262nm、278nm处测吸光值，并计算其偶联比。

本发明的有益效果：本发明合成了喹诺酮类抗生素的多簇人工抗原，合成步骤简洁，有效，经过后处理，纯度可达99％以上，完全可用于免疫分析中，为今后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明

图1半抗原的液相色谱图

图2半抗原的质谱正离子图

图3半抗原的紫外吸收图

图4抗原的紫外吸收图

具体实施方式

(1)人工半抗原的合成

合成过程：