[发明专利]实现DNA序列分析中增加测序阅读长度的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高通量测的DNA测序方法，是一种实现DNA序列分析中增加测序阅读长度的测定方法。

背景技术

随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。目前，无论是找寻新的还是确认已知SNP位点，传统的SangerDNA测序法，仍处于无可替代的地位。但这一方法存在通量低和价格高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用大约为10亿美元，目前这一费用已经降低到大约2千万美元。但是，功能基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年提出了1000美金人类全基因组测序的研究目标。2004年初，美国国立卫生院投入7千多万美元支持DNA测序新技术的研究计划，其目标是发展10万美金的测序技术，并最终减低为1千美金。美国国立卫生研究院人类基因组研究中心主任Collins教授指出：大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前国际上要完成一个哺乳动物全基因组的测序需要上千万美元。以当前最为先进的ABI Prism3730 DNA测序仪为例，完成人类基因组中30亿碱基的测序，需要150台ABI Prism3730DNA测序仪运转一年，其测序成本达到二千四百万美元。现在以Sanger DNA测序法为基础的，在发展高密度的毛细管阵列，以提高测序的并行性，进而提高DNA的测序速度这一研究思路在提高DNA测序速度和降低成本方面的改进空间也十分有限。

目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。  大部分研究在合成测序策略方面。除了对现有的基于电泳的测序技术进行改进外，当前正在发展的新型测序技术主要集中在非电泳的手段上。这类技术从总体上来看可以分成四大类：第一类是合成测序，在碱基加入到正在延伸的DNA链的过程当中进行检测；第二类技术则是杂交测序法，通过制备一组高密度寡核苷酸微阵列芯片的杂交信号，进行目标基因的序列鉴定。第三类为分子影像一系列可以在单分子的水平上进行测序的技术；最后一类技术是诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的小孔，在这个过程当中借助于电子学或者光学的方法对碱基进行读出，也称作纳米孔测序。实际上，目前只有合成测序方法有希望用于全基因组测序。合成测序法目前较为成功的例子是美国的454 Life Sciences公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina(Solexa)公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems(SOLiD)公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割高通量测序技术。

而目前的延伸合成测序方法，不管是焦测序还是标记单体的延伸测序，由于延伸反应效率、洗涤等会错误延伸的累积、测序引物的流失等，这些问题都可能导致序列阅读长度的降低，而序列阅读长度显著影响拼接组装效率。已有文献表明，当序列阅读长度为20个碱基时，需要进行50次以上的序列测定，而当序列阅读长度为80个碱基时，只需要5-6次左右的序列测定就能将人类基因组序列进行有效的完整组装。因此，提高测序的阅读长度不仅可以提高序列的准确性，而且可以大大降低序列测定的成本。

本发明的目的就是通过一种高通量测序引物，为DNA序列分析增加测序阅读长度，建立快速，准确，便宜的基因组序列测定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种实现DNA序列分析中增加测序阅读长度的测定方法，其优点在于测序阅读长度长，能够提高拼接的正确性，减少重复测定的次数，序列测定费用低。