[发明专利]一个水稻锌指蛋白基因及其耐逆性基因工程应用

权利要求书

1.水稻锌指蛋白基因ZFP207，其序列为：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述水稻锌指蛋白基因ZFP207的耐逆性基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取

选用水稻品种“韭菜青”，待水稻幼苗长至3叶期后，用150mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；

2)水稻锌指蛋白基因ZFP207的克隆

根据水稻锌指蛋白基因ZFP207的全长序列，设计两端引物：

上游引物：CCTAATACACACACACAAAG

下游引物：CTACAAACTTATAACCGCAG

以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因ZFP207的cDNA序列SEQ ID NO.1；

3)植物表达载体的构建

根据水稻锌指蛋白基因ZFP207的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物序列同步骤2)：

上游引物：GGATCCTTCTACTCCTAATACACAC

下游引物：CTACAAACTTATAACCGCAG

以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将ZFP207的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2代和对照植株进行耐逆性分析。

耐盐转基因植株的获得：将转基因植株幼苗和对照植株进行400mM NaCl的持续处理，在盐处理5天后转移到不含有NaCl的湿滤纸上继续生长，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株；

耐冷性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株的幼苗于4℃处理5d后，放置于25℃培养箱中恢复12h，恢复明显优于对照组的植株即为耐冷性增强的转基因植株；

耐旱性转基因植株的获得：将转基因植株和对照植株于300mM甘露醇中处理30天后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株。