[发明专利]网织红细胞检测试剂和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液分析领域，更具体地讲涉及网织红细胞检测试 剂和检测方法。

背景技术

网织红细胞(reticulocyte)是从骨髓释放到外周血的成熟红细胞的 前体细胞，同成熟红细胞相比，其细胞内仍残存少量的RNA(嗜碱性 物质)。越是幼稚的网织红细胞，其细胞内的RNA含量就越高，越接 近成熟的网织红细胞，其细胞内的RNA含量则越少。

血液中网织红细胞的检测在检验医学领域具有重要意义。测定 网织红细胞的基本原理就是让某种染料与细胞内RNA结合，再通过 显微镜镜检或采用流式细胞术(FCM)等方法检测被染色的网织红细 胞。根据网织红细胞内RNA含量的多少，将网织红细胞分成不同的 成熟度。

目前，国内大多数医院仍采用煌焦油蓝乙醇溶液、煌焦油蓝盐 水溶液或新亚甲蓝溶液进行染色、涂片，油镜下直接目测计数1000 个红细胞中网织红细胞数。这样的手工镜检操作繁琐，不仅需要较 长时间的染色孵育，不能有效地计算出网织红成熟指数，并且由于 操作者间的个人辨别差异以及计数量少等因素，网织红细胞计数也 产生较大的误差。

仪器分析(如使用自动血液分析仪、流式细胞分析仪等)具有几个 优势：所计数的细胞量大而减少了统计误差，测量速度快而可测定 大量血液样本，重复性好而增加可信性。目前，一般采用碱性色素 对网织红细胞内的RNA着色，然后进行识别和计数。一般有两种方 法-非荧光标记法和荧光标记法。

非荧光方式一般采用两种试剂组合，一种为使红细胞变为等体 积的球形化试剂，另一种是诸如噁嗪750(Oxazine 750)之类的对网织 红细胞进行选择性染色的染料(美国专利5,284,711、5,633,167、 5,350,695、5,438,003、5,360,739)。仪器通过测定光吸收的增加来辨 别网织红细胞与成熟红细胞，光的吸收量与胞内存在的RNA量成比 例，而仪器中的激光散射用于检测细胞体积和血红蛋白浓度。

荧光标记方式是采用RNA特异性染色的荧光性碱性色素来标记 网织红细胞内RNA，用流式细胞术测定细胞的前向散射光强度及荧 光强度。流式细胞术使用激光照射鞘流液中的血流细胞，由于红细 胞呈盘状结构，这样从不同侧面照射和收集发射光时，散射光强度 和红细胞内的荧光染料所产生的荧光强度则产生随机差异。为消除 这种差异，一般采用球形化试剂将红细胞系、血小板等溶涨成等体 积的球形，以尽量消除由于红细胞形状带来的检测误差。通常，采 用前向散射光强度-荧光强度来分析网织红细胞试剂处理的血液样 本。前向散射光强度反映了细胞的大小情况，根据细胞大小可以分 辨红细胞、白细胞、血小板。荧光强度则反映细胞内结合的荧光染 料量的关系，可以根据荧光强度分辨网织红细胞和成熟红细胞。因 为白细胞内含有大量的核酸物质，其着色的荧光染料量大大高于网 织红细胞，所以通过荧光强度也可以有效地分辨网织红细胞与白细 胞。由于红细胞只有背景荧光，因而可通过设定一定的“阈值”来 界定网织红细胞。由于网织红细胞成熟程度的不同，细胞内的RNA 含量也不同，而成熟度越高的网织红细胞，其RNA含量则越低。这 样可以根据网织红细胞内被荧光标记的RNA的多少将网织红细胞分 成高荧光率(HFR)、中荧光率(MRF)、低荧光率(LFR)三部分。越是幼 稚的网织红细胞则显示出越强的荧光，而成熟的红细胞极少或没有 荧光。由于成熟度不同的网织红细胞内的RNA含量不同，导致标记 上的荧光染料量有差异，而显示出荧光强度的差异。通过对荧光强 度的规定，可以计算出网织红细胞的成熟指数。与非荧光方式相比， 荧光染料标记的优势是灵敏度高，试剂使用量少。

荧光染料吖啶橙(acridine orange)(美国专利5,075,556、5,360,739、 5,411,891、4,336,029等)、金胺O(Auramine O)(美国专利4,985,174)、 噻唑黄(thiazole orange)(美国专利4,957,870)等荧光染料已经用于基于 流式细胞术的网织红细胞计数和成熟度分析。这类荧光染料的缺陷 是需要使用He-Ne等价格较高的激光器激发，而且生物自身的自发 荧光也在这个范围之内，产生一定的干扰。