[发明专利]体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程中用组织工程再造，器官的方法，具体涉及一种体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨以修复大节段骨缺损、股骨头坏死等大块骨缺损的治疗方法。

背景技术

目前能够用于临床的组织工程产品主要局限于几种皮肤和软骨的组织工程产品，品种和数量都非常有限，行使的功能和结构也相对简单。而临床最常见的长骨大段骨缺损是长期困扰临床医疗的难点和热点问题，其修复与重建自然成为骨组织工程研究领域最重要的主攻方向之一。但是大块组织工程骨的体内成骨过程非常复杂，是一个包括应力刺激下的涉及多种生长分化调节因子作用的骨种子细胞在支架材料内的迁移、增殖、和分化等一系列复杂有序的过程。而这些功能的行使是以血供重建为前提和保障的，迅速和有效的血供能为大块组织工程骨内部的种子细胞提供及时和充足的营养，包括各种生长分化调节因子，同时带走局部代谢所产生的废物。一般认为细胞在血管周围150-200um内才能通过弥散来保持存活，如果不能建立内在的血液循环，组织工程只能限于构建较薄而小的组织。而目前的血管化技术存在不少的问题，利用宿主体内的血管进行血管化，不仅受到局部血管条件的限制，还因为血管的长入需要一定的时间，且会增加机体额外创伤，从而制约了大块组织工程组织的构建。因此，组织工程骨的血管化问题就成为骨组织工程由基础向临床应用过渡的亟待解决的关键性技术难题，引起了广泛的关注。

生长因子对种子细胞增殖、迁移、分泌、分化活性起着至关重要的作用，而目前常用的细胞生长因子载体缓释系统存在载体的突释和持续稳定释放、降解过程中产生的分解物对细胞产生不利影响以及多因子的协同释放机制等问题尚未解决。尽管组织工程研究已深入到基因水平，但由于基因治疗普遍存在的有效性和/或安全性等问题而难以走向临床应用。

总之，大块组织工程骨血管化以及生长因子持续稳定的释放等关键性技术难题至今未找到理想的解决办法，使其临床应用受到了严重限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种为解决临床长骨大段骨缺损、股骨头坏死等长期面临的困难提供一种新的方法。以来源广泛的天然滨珊瑚或其生物衍生材料珊瑚羟基磷灰石为支架材料，根据骨缺损情况进行加工塑形，复合自体骨髓基质干细胞后形成具有高渗透性三维孔隙结构的生物活性复合物，应用临床使用的泵系统进行组装，通过少量的灌注营养液，微量生长因子的协同有序的高效作用，采用自体骨髓基质干细胞复合生物相容性良好的支架材料，具有安全高效，操作简单，成本低廉的优点。

本发明是这样来实现的：

(一)骨髓基质干细胞(BMSC)的提取、分离和培养其方法步骤如下：

(1)骨髓基质干细胞的提取：无菌条件下，于髂后上棘处骨穿针穿刺，预肝素化处理的注射器抽出骨髓约10ml。

(2)骨髓基质干细胞的分离和扩增培养：将含有1％肝素抗凝剂的骨髓置于离心管中，加入约为骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基，在1000r/min离心10min，弃去上清液，用PBS缓冲盐清洗2～3次，去除上层脂肪和组织液，将下面细胞层(含BMSCs的混合物)用完全培养基再悬，吸入培养皿中，加入完全培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱进行培养。培养约2-3w，80％融合后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA混合液消化，终止消化后进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞。

(二)珊瑚复合人工骨的制备

根据管状骨缺损的大小和形状，将天然滨珊瑚(NC)加工成内径2mm未贯通的圆桶状，超声清洗，高压蒸汽消毒后备用。用含自体血清的完全培养基将第三代BMSC制成10×10⁶/ml细胞悬液。注射器吸取BMSC悬液滴入NC，确保NC完全浸润且不渗漏，使成BMSC-NC复合物。置于37℃体积分数为5％的CO₂孵育箱中5小时后，加入含自体血清的完全培养基培养。BMSC-NC复合物体外培养5天，待BMSC与NC贴附牢固后再回植入骨缺损处。

(三)灌注系统的建立