[发明专利]具有抗血小板聚集和纤溶活性的双功能葡激酶突变体、应用及其制备方法

权利要求书

1.一种具有抗血小板聚集和纤溶活性的双功能葡激酶突变体，其特征是改变野生型Sak的N末端1～10位氨基酸序列，将RGD序列引入Sak的N末端1～10位氨基酸序列内部，紧随RGD序列后面氨基酸是S或F，将野生型Sak N末端肽链S¹S²S³F⁴D⁵K⁶G⁷K⁸Y⁹K¹⁰替换为S¹S²R³G⁴D⁵S⁶F⁷D⁸K⁹G¹⁰K¹¹Y¹²K¹³，命名为MD1-Sak；或者替换为S¹S²S³R⁴G⁵D⁶F⁷D⁸K⁹G¹⁰K¹¹Y¹²K¹³，命名为：MD2-Sak；或者替换为M¹S²R³G⁴D⁵F⁶D⁷K⁸G⁹K¹⁰Y¹¹K¹²，命名为：MD3-Sak；或者替换为M¹R²G³D⁴F⁵D⁶K⁷G⁸K⁹Y¹⁰K¹¹，命名为：MD4-Sak。

2.如权利要求1所述的具有抗血小板聚集和纤溶活性的双功能葡激酶突变体的制备方法，其特征是采取以下步骤：

(1)以野生型Sak为模板，使用上游引物、下游引物进行PCR扩增，获得Sak突变体的基因，与pBV-220质粒重组，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变；

(2)突变体基因与原核表达载体pBV-220重组形成的表达质粒，转化大肠杆菌，温度诱导MD1-Sak、MD2-Sak、MD3-Sak和MD4-Sak突变体基因的表达，表达产物以胞内可溶性蛋白的形式存在；

(3)发酵：以M9CA培养基培养工程菌，温度诱导前后用酪蛋白水解物、葡萄糖进行补料，pH用稀氨水控制，发酵参数为温度30-42℃，氧容量为≥40％，pH＝6.5-7.5；

(4)工程菌发酵后离心收集菌体，超声破碎菌体，离心，收集细菌裂解液，用离子交换和凝胶过滤色谱法纯化产品。

3.如权利要求2所述的具有抗血小板聚集和纤溶活性的双功能葡激酶突变体的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的

MD1-Sak：

上游引物：gcggaattcatgtcaagtcgcggagattcattcgacaaa

下游引物：gcgggatccttatttcttttctataacaacc

MD2-Sak：

上游引物：gcggaattcatgtcaagttcacgcggagattcattcgacaaagga

下游引物：gcgggatccttatttcttttctataacaacc

MD3-Sak：

上游引物：gcggaattcatgtcacgcggagattcattcgacaaagga

下游引物：gcgggatccttatttcttttctataacaacc

MD4-Sak：

上游引物：gcggaattcatgcgcggagattcattcgacaaagga

下游引物：gcgggatccttatttcttttctataacaacc。