[发明专利]稻谷中黄曲霉毒素的免疫亲和柱—荧光光度的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域。

背景技术

测定谷物中黄曲霉毒素的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。这些方法或多或少都具有如下不足之处：

(1)在操作过程中，需要使用剧毒的黄曲霉毒素作为标定标准物，对操作人员安全造成危害。

(2)操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。

(3)仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。

(4)灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。

目前，国内外普遍采用的“黄曲霉毒素免疫亲合柱——荧光光度计法”是以单克隆免疫亲合柱为分离手段，用荧光计作为检测工具的快速分析方法。它克服了TLC(薄层色谱法)和HPLC(高效液相色谱法)法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、异味的有机溶剂，危害操作人员人身安全和污染环境的缺点。黄曲霉毒素免疫亲合柱荧光光度计法比传统的HPLC法更加安全、可靠、灵敏度和准确度高。它采用单克隆抗体免疫技术，可以特效性地将黄曲霉毒素或其它真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。

国家标准GB/T 18979-2003(食品中的黄曲霉毒素的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)，此方法适用于玉米、花生及其制品(花生酱、花生仁、花生米、大米、植物油脂、酱油、食醋等食品中的黄曲霉毒素的测定；GB/T 18980-2003(牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M₁的测定——免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法)主要适用范围牛奶、奶粉中黄曲霉毒素M₁含量的测定。

免疫亲和柱-荧光光度法的检测黄曲霉毒素的原理

经过甲醇-水提取，提取液经过过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质的抗体上。用清水将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。甲醇洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素的总量。

国标GB/T18979-2003中黄曲霉毒素的检测方法中2.4.1中大米、玉米、小麦、花生的黄曲霉毒素检测方法如下：

1试剂和溶液

1.1水：本方法提到的水均指重蒸水

1.2甲醇：色谱纯

1.3甲醇-水(7+3)：取70mL甲醇加水30mL

1.4氯化钠(Nacl)：分析纯

1.5 PBS缓冲溶液：8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，

用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节PH值至7.0，最后用纯水稀释到1000mL。

1.6吐温-20/PBS溶液(0.1％)：取1mL吐温-20，加入PBS溶液稀释至1000mL。

1.7溴溶液储备液溶液(0.01％)：称取适量溴，溶于水，配成0.01％的储备液，4℃避光保存。

1.8溴溶液工作液(0.002％)：取10mL0.01％的储备液加入40ml水混匀。于棕色瓶中保存备用。需每次使用前配制。

1.9硫酸溶液(0.05mol/L)：取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量的水中，冷却后定容到1000mL.1.10荧光光度计校准溶液：称取3.40g硫酸奎宁用0.05mol/L硫酸溶液稀释至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于20μg/L黄曲霉毒素标准溶液。

2仪器和设备

2.1荧光光度计

2.2高速均质器：18,000r/min～22,000r/min

2.3黄曲霉毒素免疫亲和柱

2.4玻璃纤维过滤纸：直径11cm，孔径1.5μm

2.5玻璃注射器：10mL，20 mL。

2.6玻璃试管：直径12mm，知75mm，无荧光性。

2.7空气压力泵。

3分析步骤

3.1提取

准确称取经过磨细的(小于2mm)的25.0g于250mL具塞三角瓶中，加入5.0g氯化钠及准确125.0mL(V₁)甲醇-水(7+3)，以均质器高速搅拌2min。定量滤纸过滤，准确移取15.0mL(V₂)滤液并30.0mL(V₃)稀释。用玻璃纤维滤纸l～2过滤次，至滤液澄清，备用。

3.2净化