[发明专利]一种检测登革热病毒的试剂盒及其专用扩增引物与探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的试剂盒及其专用扩增引物与探针，特别是涉及一种检测登革热病毒(DV)的试剂盒及其专用扩增引物与探针。

背景技术

登革热是一种流行于热带、亚热带地区的世界上分布最广、发病人数最多的急性虫媒病毒传染病。登革热由登革病毒所引起，登革病毒分为4型，即登革I/II/III/IV型，藉伊蚊为其传播病媒。据WHO统计，每年登革热感染人数有5000万，其中登革出血热约50万，死亡在2万人以上，受到威胁人口达25亿，登革热已成为全球最大的公共卫问题。

我国曾先后出现由I/II/III/IV型登革热病毒引起的登革热疫情，但截至目前我国登革热仍是输入性的或输入引起本地传播。近年来，广东、海南、广西、福建等均出现过本地传播引起的暴发疫情，而且每年都有多个省发现输入病例。由于登革热没有特异性的治疗方法，也没有有效的疫苗进行预防，因此及时发现登革热疫情、阻止或减少本地登革热疫情传播就变得尤为重要。面对这种形势，研制一种快速有效的诊断方法非常重要。

到目前为止，登革热病毒的检测最原始、经典的方法是特异性病毒分离培养，但由于操作繁琐、技术难度大耗时长、实验条件要求高、存在严重的生物安全问题，在实际工作中难以推广应用。ELISA法与病毒分离培养及基因检测法相比，会产生一定的假阳性。而且目前市场上登革热病毒的PCR检测试剂盒只能以登革热I/II/III/IV型分别检测，耗时较长，检测过程繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测登革热病毒的专用引物和探针。

本发明所提供的专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO：2所示，所述专用探针，其碱基序列如SEQ IN NO：3所示。

所述探针的一端连接有荧光淬灭基团TAMRA，另一端连接有荧光报告基团FAM。

在通常的使用过程中，荧光淬灭基团一般为一个，连接在探针的3’端，荧光报告基团也为一个，连接在探针的5’端。具体的，  5’端的荧光发射基因可以是6-羧基荧光素(其荧光发射峰值在518nm处)，3’端的荧光淬灭基团可以是6-羧基四甲基若丹明(荧光发射峰值在582nm处)。

本发明的第二个目的是提供一种用于登革热病毒检测的试剂盒。

本发明所提供的登革热病毒检测试剂盒包括上述检测登革热病毒通用引物及特异性探针。

为了方便使用，本发明所提供的登革热病毒检测试剂盒还包括含有登革热病毒基因PCR扩增试剂，以及登革热病毒RNA标准品。

所述登革热病毒基因PCR扩增试剂包括Probe RT-PCR Master Mix、Probe RT-PCRBuffer。

本发明的第三个目的是提供一种利用上述试剂盒对登革热病毒进行检测的方法。

本发明所提供的检测登革热病毒的方法，是以待测样品血清或血浆中的提取物中的总RNA为模板，反转录合成cDNA，再以该cDNA为模板，用上述检测登革热病毒的试剂盒进行荧光定量PCR检测。

本发明针对现有登革热病毒检测方法费时、费力的缺点，提供了一种操作方便、特异性较强、灵敏度较高的检测登革热病毒的试剂盒。适用于目前发现的登革热I/II/III/IV所有类型病毒的检测和定量，可广泛用于登革热病毒感染的监测和诊断，具有重要的实际应用价值。利用本发明方法对广东省检验检疫局提供的103名登革热患者(其中I型患者45名，II型患者21名，I型患者19名，IV型型患者18名)进行检测，结果表明，阳性率为99％，说明本发明的方法的检出率是非常高的。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、检测登革热病毒的专用引物和探针的设计

根据对NCBI数据库登革热I～IV型病毒基因序列分析，以Genbank号分别为EF032590、NC_001474、DQ401690、AF326573的保守序列，经ClustalW软件对比找出其保守序列区的相同序列，经NCBI-Blast分析与其他病毒和微生物无同源性序列，并且在此区域设计探针。

其专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO：2所示。专用探针的碱基序列如SEQIN NO：3所示。

实施例2、用本发明的试剂盒对待测样本进行荧光定量检测

1、反应液制备