[发明专利]银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织或细胞的繁殖方法，尤其涉及含有较高黄酮类化合物的银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，属于植物生物技术领域。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是原产我国的古老孑遗植物，集药用、食用、观赏、材用于一体，银杏叶中存在特有的两类重要生理活性物质——黄酮类化合物(flavonoides)和萜内酯(银杏内酯ginkgolides，GKs包括A，B，C，J，M和白果内酯bilobalides，BB)。这两类药物对中老年冠心病、高血压等心脑血管病、内毒素休克、器官排异反应、气管炎、哮喘等均有较好的效果。另外银杏药物还具有抗衰老、抗老年性痴呆症、增强记忆力的功效，用于研制营养口服液、保健食品和化妆品等添加剂。

由于银杏制品存在着巨大的市场潜力，先后在法国、德国、韩国、美国、日本等掀起了银杏叶制剂、药品的研制、开发与销售，世界上银杏制剂的年销售额为20亿～40亿美元。在大力开发研制银杏产品的同时，存在着对资源的掠夺，人力物力的浪费。

银杏黄酮和萜内酯主要来源于银杏叶片，但含量很低，银杏叶黄酮含量为0.3％～3.8％，萜内酯在银杏叶内含量更低，比黄酮含量低一个数量级(约0.1％～0.3％)大面积的建立叶用林是不现实的，同时存在地理环境、季节等诸多因素的限制，且提取、分离时操作繁琐费时。利用植物细胞或愈伤组织的大量培养生产银杏次生物质代谢产物，可以工业化的生产银杏黄酮类化合物，是银杏黄酮类化合物的一条有效制备途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，由该快速繁殖方法所制备得到银杏愈伤组织或悬浮细胞有较高含量的银杏黄酮类化合物，可以规模化的为药厂提供银杏黄酮化合物的来源。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶源的获得、愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养等步骤，其主要步骤如下：

1、按照常规植物组织培养的芽或叶片增殖的方法，获得大量无菌的银杏芽苗或叶片；

2、将步骤1所获得的银杏无菌芽苗或叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，初代培养后连续继代5～6次，获得松散的愈伤组织；

3、将步骤2所获得的松散愈伤组织接种在含有萘乙酸(Naphthalene-aceticacid，NAA)、激动素(Kinetin，KT)的MS(MS培养基的配方请参考下述文献：刘庆昌，吴国良主编的植物细胞培养技术[M]，中国农业大学出版社，33)液体培养基中振荡培养，其中继代培养2次，得到液体悬浮培养细胞；

4、将所得到的液体悬浮培养细胞接种在下述任意一种液体培养基中进行振荡培养：(1)MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(2)MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～5mg/L；收集细胞培养物，即得；或将步骤2中所得到的愈伤组织继代在下述任意一种固体培养基上培养：(1)MS固体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(2)MS固体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～5mg/L，收获愈伤组织培养物，即得。

上述制备方法中，优选的，步骤1中所述的银杏芽或叶片增殖的方法，步骤如下：

(1)将银杏成熟种胚消毒后接种在DCR、WPM 3或改良MS中的任一种基本培养基上，培养(优选培养30天)形成幼苗；其中，所述的种胚消毒方式优选如下：将银杏成熟种胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl₂浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水分；

(2)取步骤(1)所得到的无菌幼苗，剪取(优选为剪取1cm左右)带芽茎段接种在下述的任意一种固体培养基上进行芽和叶片的诱导培养(优选为培养1个月)：改良MS固体培养基+NAA0.1～0.5mg/L+6-苄基嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)0.5～1.0mg/L，或DCR培养基+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L；

(3)将步骤(2)所获得的芽或叶片转接到改良MS或DCR基本培养基中培养(优选为培养1个月)，进行芽的增殖和叶片的生产，获得大量无菌的银杏芽苗或叶片。