[发明专利]与绿豆抗豆象基因连锁的分子标记

权利要求书

1.与绿豆抗豆象基因连锁的分子标记是通过下述方法筛选出的：

(1)利用来源于印度的抗豆象栽培绿豆V2709，与感豆象绿豆品种VC1973A(中绿1号) 进行杂交，F₁种子自交产生F₂；

(2)用CTAB法提取V2709、VC1973A(中绿1号)及其杂交F₂后代分离群体的单株DNA；

(3)采用RAPD、SSR、STS分子标记进行绿豆抗豆象标记的筛选；

(4)共筛选出2个标记，为1个RAPD标记和1个STS标记。

2.根据权利要求1所述与绿豆抗豆象基因连锁的分子标记，采用的RAPD分子标记进行绿豆 抗豆象基因标记的筛选方法为：

用1个RAPD引物OPC-06对V2709和VC1973A(中绿1号)亲本DNA多态性进行初 步分析；

PCR反应体系为：模板DNA10ng/ul 2ul；RAPD引物5pmol/ul 1.5ul；10×缓冲液2ul； dNTP2.5mM 0.4ul；MgCl₂25mM 1.2ul；Taq酶2.5U/ul 0.2ul；ddH₂O 12.7ul；反应总量20ul；

PCR反应程序为：DNA95℃预变性5min后；95℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸 Imm15s，循环44次；最后72℃延伸5min；

在DNA扩增仪PTC-200上进行扩增，扩增产物在含有EB的1.5％琼脂糖凝胶上进行分 离鉴定，然后在自动凝胶扫描系统观察、拍照、记录实验结果。

3.根据权利要求1所述与绿豆抗豆象基因连锁的分子标记，采用的STS分子标记进行绿豆抗 豆象基因标记的筛选方法为：

用1个STS引物STSbr2对V2709和VC1973A(中绿1号)亲本DNA多态性进行初步 分析；

PCR反应体系为：模板DNA10ng/ul 3ul；STS引物对2pmol/ul 1.5ul；10×缓冲液2ul， dNTP2.5mM 0.4ul；MgCl₂25mM 1.2ul；Taq酶2.5U/ul 0.3ul；ddH₂O11.6ul；反应总量20ul；

PCR反应程序为：DNA95℃预变性5min后；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s， 循环35次；最后72℃延伸5min；

在DNA扩增仪PTC-200上进行扩增，扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定， 银染显色，然后在可见透射仪上观察、记录实验结果。