[发明专利]一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物粘合剂，尤其是涉及一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法。

背景技术

海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，是沿岸和近海中普遍存在的一种生物，其足丝腺能分泌足丝附着在坚硬的基体上，使它们能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于礁石而不分离。这种足丝粘胶的主要成分足丝粘附蛋白具有高强度、高韧性和防水性。目前已有美国BD Bioscience公司从紫贻贝(Mytilus edulis)的足部提取到粘附蛋白，用作细胞和组织粘附剂，该产品已商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAK^TM CELL AND TISSUE ADHESIVE，Catalog No.354240，354241。该产品可涂覆用于细胞培养和组织切片等的玻片、塑料或金属表面以增强与样品的粘附。但是贻贝分泌粘附蛋白的量极少，从大约10000个贻贝中也仅能提取到1mg的粘附蛋白，而且由此获得的粘附蛋白产品如CELL-TAK^TM价格也十分昂贵，很难满足需要。

已有文献报道用基因工程手段表达重组的粘附蛋白用作生物粘合剂，他们用原核表达载体pTrcHisA重组紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的Mgfp-3A、Mgfp-5以及Mgfp-5与Mgfp-1的十肽重复序列融合蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有较好的粘附功能(1、Hwang DS，GimY Cha HJ.Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichiacoli[J].Biotechnol Prog，2005，21(3)：965-970；2、Hwang DS，Gim Y，Kang DG，et al.Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial[J].J Biotechnology，2007，127(4)：727-735；3、Hwang DS，Gim Y，Yoo HJ，et al.Practical recombinant hybrid musselbioadhesive fp-151[J].Biomaterials，2007，28(24)：3560-3568)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法。

本发明的具体步骤如下：

1)从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA；

2)根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自Genbank No.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有EcoR I和Sal I酶切位点，引物序列如下：

引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，

引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’：

3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360bp)序列如下：

Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttat

aaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagc

caaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaaccta

agatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg