[发明专利]一种高产没食子酸的茶条槭悬浮细胞系

说明书

技术领域

本发明涉及一种产没食子酸的茶条槭悬浮培养细胞，具体讲是以植物细胞培养技术为手段，通过在细胞培养器中进行的茶条槭悬浮细胞培养，并在悬浮细胞中分离产生没食子酸。本发明属于生物工程领域。

背景技术

茶条槭(Acer ginnala Maxim)属槭树科，槭树属；为落叶小乔木或灌木，株高可达8-10米；树形优美，叶型清秀，尤其是秋后叶色鲜红艳丽，极具观赏价值，是园林绿化和观赏树种。茶条槭在我国主要分布在东北山地、内蒙古及华北山地，长江流域也有生长，在黑龙江省主要分布在小兴安岭、完达山、张广才岭等山区，具耐寒抗风雪的特性，因此是一难得的东北地区绿化树种。茶条槭嫩叶可制成茶叶，具有生津止渴，退热明目之功效；更主要的是茶条槭树叶中含有大量的没食子酸(Gallic acid，GA)，即3、4、5-三羟基苯甲酸，没食子酸是医药、纺织、石油、化工、机械、国防、轻工业、塑料、食品等工业的重要原料，在医药工业中，没食子酸及其衍生物对冠心病、脑血栓、胃溃疡、抗菌、抗血吸虫、抗病毒性肝炎、老年性痴呆、抗肿瘤等显示出多方面的功效，在化工、轻工、食品等方面，没食子酸作为原料均有广泛的应用。

目前销售价格在8～10万元·t^-1。现今市场对没食子酸的需求量越来越大，仅黑龙江省每年就计划生产600吨，需茶条槭干叶8000吨左右。这种方式使茶条槭基因资源遭到了很大浪费和破坏，原料的质量和数量很难得到保证，此外，叶片也受到季节的限制，同时，天然树叶中没食子酸含量很低。因此没食子酸的原料保障就成为其是否能成功走向市场的最为关键因素，植物细胞培养是解决问题的有效途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产没食子酸的茶条槭悬浮细胞，来代替茶条槭叶片。此细胞生长快、周期短、不受季节限制、产没食子酸。

为了达到上述目的，本发明经过多年的时间，在分析、研究国内外没食子酸研究成果的基础上，系统的研究了植物组织细胞悬浮培养技术应用到茶条槭有效次生代谢产物没食子酸的理论、技术及可行性，包括从材料选择、外植体诱导、悬浮培养系的建立过程，完成了实验室研究，建立了茶条槭悬浮培养体系，获得了大量的茶条槭悬浮培养细胞，并检测此细胞产没食子酸。

本发明所采用的技术方案是：取茶条槭组培苗的幼嫩叶片或茎段，在固体培养基中得到愈伤组织，然后将愈伤组织转入液体培养基中进行悬浮培养并筛选高效合成没食子酸的悬浮细胞系。培养选出的细胞系，收获细胞，提取没食子酸。选出的细胞系采用继代保存和-196℃液氮中保存。

本发明的优点是：

1、本发明用茶条槭悬浮细胞代替叶片，保护了环境资源。

2、本发明的茶条槭悬浮细胞生长快、周期短、不受季节限制。

3、本发明的茶条槭悬浮细胞生产没食子酸比用茶条槭叶片生产没食子酸提高了81.6倍。

4、本发明的茶条槭悬浮细胞成本低，所需劳动力少。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作进一步详细描述：

本发明取茶条槭组培苗的幼嫩叶片和茎段为外植体，接种于WPM+TDZ0.01mg/L+6-BA0.1mg/L固体培养基中，23-25℃，光照培养15天获得愈伤组织。

然后，将愈伤组织转入WPM+TDZ0.002-0.01mg/L+6-BA0.05-0.15mg/L固体培养基中继代培养，7-15天1继代。

选择长势好的愈伤组织转入3倍的大量元素WPM液体培养基中，激素为TDZ0.004mg/L和6-BA0.1mg/L，蔗糖为2％，pH值为5.8-6.0，

培养条件：23-25℃，120转/min，光照8h/d，光照强度1600Lx。28天为一周期，3代后吸取悬浮液转入固体培养基上铺板，3周后长成细胞系，分别取不同颜色和质地的生长旺盛细胞系进行一个继代的悬浮培养，扩大繁殖后，重新继代，1个周期后收集细胞，测定没食子酸含量，筛选没食子酸含量高且细胞生长迅速的悬浮细胞系。

悬浮细胞系的超低温保存：取培养14d的细胞进行超低温保存；10％二甲基亚砜(DMSO)+8％葡萄糖作为冰冻保护剂；按如下程序降温：在0℃中预处理30min后移入-20℃中停留180min，然后转入-70℃中停留30min，最后投入-196℃液氮中保存。