[发明专利]瘤形成特异性tNOX异形体和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求以2006年9月1日提交的两份申请，即美国临时申请60/824,398和美国临时申请60/824,333作为优先权基础，通过引用将这两份申请的内容纳入本文，只要其内容与本公开的内容没有冲突。

技术领域

本发明的领域为蛋白质生物化学领域，具体而言，本发明涉及瘤细胞和病变细胞的诊断，具体涉及细胞表面标志的特定异形体，所述细胞表面标志是总体上瘤形成的特征，并且具有可指明特定癌症类型的特定蛋白质表达模式。特定异形体的检测是通过使用特异性抗体进行的。

背景技术

存在一种独特的、与生长有关的细胞表面氢醌或NADH氧化酶家族，它们具有蛋白质二硫化物-硫醇互变活性，被称为ECTO-NOX蛋白(意思是细胞表面NADH氧化酶)(1，2)。ECTO-NOX家族的一个成员被命名为tNOX(意思是肿瘤相关的)，它特异性地存在于癌细胞表面和癌症患者血清中(3，4)。tNOX蛋白的存在已经在几种人肿瘤组织(乳腺癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、结肠癌和黑色素瘤)中得到证实(5)，血清分析表明它与人类癌症的联系要广泛得多(6，7)。

NOX蛋白是锚定于质膜外侧小叶上的外蛋白(ectoprotein)(8)。与其他外蛋白实例(唾液酸转移酶和半乳糖转移酶、二肽基氨肽酶IV等)的特征一样，NOX蛋白也是分泌性的。它们在培养细胞的条件培养液(5)和患者血清(6，7)中呈现可溶形式。来自癌症患者的tNOX的血清形式与膜结合形式显示出相同程度的药物应答性。药物应答性tNOX活性在多种癌症病人的血清中都能观察到，包括白血病、淋巴瘤或实体瘤(前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌)患者(6，7)。tNOX蛋白具有极强的稳定性和蛋白酶抗性(9)，这有助于解释它能够在癌症患者的血清中积聚到易被检测的水平。相反，在健康志愿受试者的血清中(6，7)或非肿瘤疾病患者的血清中，未发现药物应答性NOX活性。

虽然细胞表面tNOX的癌症特异性的基础还没有确定，但有几方面强有力的证据可以支持这种概念。经过精确测定，在未转化的人和动物细胞和组织的质膜中，不存在药物应答性NOX活性(3)。tNOX蛋白缺少跨膜结合区(10)，在低pH下经过短暂处理即可脱离细胞表面(9)。在健康志愿受试者的血清中或非癌症疾病患者的血清中，未检测到药物应答性tNOX活性(6，7)。当使用转化的细胞和组织或者来自癌症疾病患者的血清作为抗原来源时，在蛋白质印迹分析或免疫沉淀分析中，几种tNOX抗血清已经在34kDa处(一种细胞表面形式的tNOX的加工后分子量)识别出免疫反应条带(5，10，11)。当使用未转化的细胞和组织或者来自健康志愿受试者或非癌症疾病患者的血清时，在蛋白质印迹分析或免疫沉淀分析中，在34kDa处不出现免疫反应条带(5，10，11)。这些抗血清包括：单克隆抗体(5)、可与来自正常细胞和瘤细胞的细胞表面NADH氧化酶反应的单链可变区片段(scFv)、通过对表达的tNOX应答而制备的多克隆抗血清(11)以及针对tNOX的保守性腺嘌呤核苷酸结合区的多克隆肽抗血清(11)。

tNOX cDNA已经被克隆(GenBank编号AF207881；11；美国专利公布2003-0207340A1)。由可译框架得到的分子量为70.1kDa。功能性基序包括醌结合位点、腺嘌呤核苷酸结合位点和CXXXXC半胱氨酸对，所述半胱氨酸对作为基于定向诱变的潜在的蛋白质二硫化物-硫醇互变位点(11)。根据可用的基因组信息(12)，tNOX基因位于X染色体上，它包括多个外显子(13)。已知有多种剪接变体mRNA和蛋白质被表达。

可产生对肿瘤NADH氧化酶有特异性的单克隆抗体MAB12.1的杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心，地址为Manassas，Virginia，20108，保藏日期为2002年4月4日，保藏编号为ATCC PTA-4206。该保藏物将在ATCC保藏中心限制性保存，时间为从保藏日起30年，或者从最近一次请求起5年，或者在专利的有效期内，以上述期限中最长的时间为准，在此期间若发生保藏物失活则应替换。该单克隆抗体记载于2006年5月30日颁发的美国专利7,053,188中，该专利的内容通过引用纳入本文。

因为癌症对人类健康有着严重的威胁，并且癌症导致巨大的经济损失，长期以来本领域一直需要一种可检测癌症存在的、经济有效的、技术上简单的系统。

发明内容