[发明专利]编码大约45kDa的杀虫蛋白质的植物最优化的多核苷酸

说明书

本申请为分案申请，其母案申请的申请日为1999年10月21日，申请号为99812497.4，发明名称为“编码大约15kDa和大约45kDa的杀虫蛋白质的植物最优化的多核苷酸”。

发明背景

昆虫和其它害虫使农民每年的作物损失和控制这些害虫的花费达亿万美元。昆虫害虫造成的农业生产环境的损失包括作物产量的减少、作物质量的降低和收获成本的提高。

化学杀虫剂已经提供了控制害虫的有效方法；然而，公众已经开始担心可能在食品、地下水和环境中发现的化学品残留量。因此，合成的化学杀虫剂正日益受到仔细考查，尤为正确的是考查其潜在的毒性环境后果。合成的化学杀虫剂可以毒害土壤和下伏含水层，因径流而污染地面水，并且破坏非目标生命形式。合成的化学控制剂的另一个缺点是，当它们施用于宠物、农畜或儿童可能与其接触的区域时，会引起公共安全方面的危害。它们还可能对施用者的健康造成危害，尤其是在没有遵循正确的施用方法时。全世界的管理部门都在限制和/或禁止使用许多杀虫剂，特别是那些在环境中持久而且进入生物链的合成化学杀虫剂。广泛应用的合成化学杀虫剂的实例包括有机氯类，例如DDT、灭蚁灵、开蓬、林丹、艾氏剂、氯丹、涕灭威和狄氏剂；有机磷酸酯类，例如毒死蜱、对硫磷、马拉硫磷和二嗪磷；以及氨基甲酸酯类。对使用杀虫剂的严格的新限制以及从市场上淘汰某些有效的杀虫剂都可能限制对控制代价高的害虫的经济而有效的选择。

鉴于与使用合成化学杀虫剂有关的问题，显然需要限制这些作用剂的使用而且需要确定其它的控制剂。取代合成化学杀虫剂，或组合应用这些作用剂和生物杀虫剂，可以降低环境中毒性化学品的水平。

正日益普及应用的一种生物杀虫剂是土壤微生物苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)。该土壤微生物苏云金芽孢杆菌(B.t.)是一种革兰氏阳性、产芽孢杆菌。B.t.的大多数菌株不显示杀虫活性。一些B.t.菌株产生伴胞晶状蛋白质包含体，并且可以伴胞晶状蛋白质包含体作为其特征。这些一般具有特异性的杀虫活性的“δ-内毒素”不同于那些具有非特异性的宿主范围的外毒素。这些包含体在显微镜下观察时经常表现为独特形状的晶体。这些蛋白质对害虫可以是高度毒性的并且在其毒性活性方面是特异性的。

多年来，使用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(B.thuringiensissubsp.kurstaki)的芽孢和晶体的制剂作为鳞翅目害虫的商用杀虫剂。例如，苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克变种HD-1(B.thuringiensisvar.kurstaki HD-1)产生一种对许多鳞翅目昆虫的幼虫有毒的晶状δ-内毒素。

早于十五年之前，出版的文献中就描述了B.t.晶状蛋白质基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的克隆化和表达(Schnepf，H.E.，H.R.Whiteley[1981]Pro.Natl.Acad.Sci.USA78：2893-2897.)。美国专利No.4,448,885和美国专利No.4,467,036都公开了B.t.晶状蛋白质在大肠杆菌中的表达。基于重组DNA的B.t.产物已生产出来并得到批准使用。

最初，B.t.杀虫剂的商业使用被限制于窄范围的鳞翅目(毛虫)害虫。然而，近期研究者已发现了对范围宽得多的害虫有特异性的B.t.杀虫剂。例如，B.t.的其它种，即，以色列种(israelensis)和莫里逊种(morrisoni)(a.k.a.tenebrionis，a.k.a.B.t.M-7)已经分别在商业上用于控制双翅目和鞘翅目的昆虫(Gaertner，F.H.[1989]“Cellular Delivery Systems forInsecticidal Proteins：Living and Non-Living Microorganisms”，参见Controlled Delivery of Crop Protection Agents，R.M.Wilkins，编辑，Taylor and Francis，New York and London，1990，pp.245-255)。