[发明专利]α－半乳糖苷酶缺陷的治疗

权利要求书

1.含人α-Gal A制剂的组合物，如SDS-PAGE或反相HPLC测量，纯化至至少99.5％同质性，其中所述制剂包含多种α-Gal A糖形式且具有至少3.0×10⁶单位/mg蛋白质的比活性，而且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。

2.权利要求1的组合物，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖至少35％带电荷。

3.权利要求1的组合物，如Z数目测量的，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖电荷超过150。

4.权利要求1的组合物，其中所述α-Gal A糖形式的总聚糖至少60％唾液酸化。

5.权利要求4的组合物，其中所述制剂的循环半衰期延长。

6.用于生产含多种α-Gal A糖形式的纯化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a)在平衡缓冲液中于酸性pH使所述α-Gal A糖形式结合阳离子交换树脂，

b)用所述平衡缓冲液清洗所述树脂以洗脱未结合的物质，并

c)使用选自下组的洗脱溶液洗脱所述α-Gal A糖形式：10-100mM的盐溶液、pH4-5的缓冲液、及其组合，

其中所述α-Gal A制剂纯化至至少99.5％同质性，且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。

7.权利要求6的方法，还包括选自下组的纯化步骤：层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、和免疫亲和层析法。

8.含多种α-Gal A糖形式的α-Gal A制剂，纯化至至少99.5％同质性，由权利要求6的方法生产。

9.用于生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将编码GlcNac转移酶III(GnT-III)的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源CnT-III基因的表达；

b)在能够表达α-Gal A和GnT-III的培养条件下培养所述α-Gal A生产细胞；并

c)分离α-Gal A，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A多。

10.权利要求9的方法，其中所述α-Gal A制剂的寡糖至少35％带电荷。

11.权利要求9的方法，其中所述α-Gal A制剂包含多种糖形式，所述糖形式的复合聚糖至少20％含2-4个唾液酸残基。

12.权利要求9的方法，如Z数目测量的，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷超过150。

13.权利要求9的方法，其中所述制剂包含多种糖形式，所述糖形式平均至少25-50％磷酸化。

14.寡糖电荷增加、由权利要求9-13任一项的方法生产的糖基化α-Gal A制剂。

15.用于生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤：

a)将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源唾液酰基转移酶的表达；

b)在能够表达α-Gal A和唾液酰基转移酶的培养条件下培养所述α-Gal A生产细胞；并

c)分离α-Gal A，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A多。

16.权利要求15的方法，还包括下列步骤：

d)通过分离或纯化步骤(c)的制剂来选择大小或电荷增加的α-GalA糖形式。

17.寡糖电荷增加、由权利要求15或16的方法生产的糖基化α-GalA制剂。

18.用于生产唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括使α-Gal A生产细胞接触铵浓度低于10mM的培养基的步骤。

19.权利要求18的方法，其中接触步骤包括用新鲜培养基连续或间歇灌注所述α-Gal A生产细胞以维持铵浓度低于10mM。