[发明专利]检查痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检查病毒制备物中的外源病毒污染物的方法。特别地，本发明涉及检查痘病毒或其重组病毒、特别是痘苗病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法。

背景技术

病毒制备物在毒种选育和生产过程中，都需要使用动物或细胞作为培养基质。作为培养基质的细胞可能存在病毒污染，因此有可能造成病毒制备物被外源因子(特别是外源病毒)所污染。为保证产品质量，需要对毒种和作为培养基质的细胞进行外源病毒检查。

通常，毒种外源病毒检查的原理是：使用非人源和非猴源的特异性抗血清中和适当稀释的毒种。将中和后的病毒悬液接种细胞(简称“细胞法”)、动物(简称“动物法”)或者鸡胚(简称“鸡胚法”)，观察是否有外源病毒的存在。其中细胞法是较为简便，且使用最多的方法。细胞法的具体步骤包括：将中和后的病毒悬液分别接种人源、猴源和生产用细胞，并将细胞于36±1℃培养2周；镜下观察是否有细胞病变或血球吸附现象；如结果无细胞病变和血球吸附现象则表明毒种无外源病毒污染(XII C病毒外源因子检查，《中国药典三部》，2005)。

然而细胞法不能用于检查一些不能被特异性抗血清完全中和的病毒(“不完全中和病毒”)的制备物中是否存在外源病毒污染，这类不能被特异性抗血清完全中和的病毒例如为痘病毒等。这类病毒即使在经适当稀释后仍不能被其特异性抗血清完全中和，接种细胞后未被中和的病毒也将与外源病毒类似地产生细胞病变或血球吸附现象，导致无法判断结果。因此这类病毒及其重组病毒制备物无法在细胞上完成外源病毒污染物的检查。

这类不能被特异性抗血清完全中和的病毒通常用动物法和鸡胚法进行外源病毒污染物的检查，即将经特异性抗血清中和后的病毒悬液接种小鼠和乳鼠的脑室和腹腔、鸡胚尿囊腔和卵黄囊。试验判定标准是：(1)7天后鸡胚尿囊液血球凝集试验阴性且80％鸡胚存活；(2)14天后乳鼠80％存活且死亡动物无病毒感染，解剖死亡的乳鼠，取病变组织、脑、脾制成细胞悬液再次接种乳鼠，观察14天，乳鼠无病毒感染现象；(3)21天后小鼠80％存活且死亡动物无病毒感染；解剖死亡的小鼠，取病变组织、脑、脾制成细胞悬液再次接种小鼠，观察21天，小鼠无病毒感染现象。当鸡胚、乳鼠、小鼠试验均为阴性时，表明无外源病毒污染(XII C病毒外源因子检查，《中国药典三部》，2005)。该方法操作复杂，耗时长，且易受外界因素影响。

PCR和免疫化学方法是WHO建议的方法(参见，WHORECOMMENDATIONS FOR PRODUCTION AND CONTROL OFSMALLPOX VACCINE * REVISED 2003，p5)，但迄今为止这两种方法均未建立，其最大的技术障碍在于，无法囊括所有可能存在的外源病毒，极易造成漏检。

发明内容

本发明针对不能被其特异性抗血清完全中和的痘病毒或其重组病毒提出了一种在细胞上进行痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的检查的新方法。

应用本发明的方法，可以实现在细胞上对痘病毒(特别是痘苗病毒)或其重组病毒制备物进行外源病毒污染物的检查。

具体而言，本发明提供了一种检查痘病毒或其重组病毒制备物中的外源病毒污染物的方法，该方法包括以下步骤：

a)将待检痘病毒或其重组病毒制备物用对应的痘病毒特异性抗血清进行中和；

b)将中和后的病毒悬液经滤膜过滤；和

c)将滤液接种细胞，

其中所接种的细胞产生细胞病变或血球吸附现象表明所述痘病毒或其重组病毒制备物存在外源病毒的污染。

在前述方法中，还可进一步包括在步骤a)之前用滤膜对待检痘病毒或其重组病毒制备物进行过滤以除去制备物中的细胞碎片的步骤。

在前述方法中，采用孔径大于0.22μm的滤膜在中和之前对病毒制备物进行过滤以除去其中的细胞碎片；采用孔径为约0.22μm的滤膜过滤中和后的病毒悬液。

特别地，在本发明的方法中所述痘病毒是痘苗病毒。

附图说明

图1：将痘苗病毒天坛株制备物用特异性抗血清中和后经0.22μm孔径的滤膜过滤，将所得滤液接种CEF细胞后的显微照片。从图中可见，接种后的CEF细胞后未出现细胞病变。

图2A：将痘苗病毒天坛株制备物用特异性抗血清中和后不经过滤直接接种CEF细胞，然后用血球吸附法显示病变部位。从图中可见，接种后的CEF细胞出现了细胞病变，且出现病变的细胞表面均吸附了鸡血球。